• Santé - Concentration, Tampon, Protéine

[Biologie Moléculaire] gel 1D

pourtant après dosage la quantité de protéines semble suffisante j'ai par exemple 1.6µg/µl je ramène tout les échantillons à cette concentration, j'ai engagé une plus grande quantité de protéine 65µg. j'ai vérifié les pH des tampon tris pour les deux gels (concentration et séparation) je travaille avec la même source.  [...] je voudrai savoir aussi si le fait de d'augmenter la tension un peu peut provoqué ça je fais ça parfois quand je viens le matin pour activer la migration, mais j'ai toujours eu l'habitude d'avoir de beau gels.   [...]

[Biochimie] Tampon de purification, NaCl et KCl

La protéine étant plus stable dans le PO4 (que dans le Tris), je suis passé à un tampon K2HPO4 / KH2PO4. Pour éviter d'introduire trop d'ions différents, je voudrais utiliser du KCl à la place du NaCl. Je constate que dans la littérature, il est fréquent que celui-ci soit utilisé à des concentrations moindres, mais je ne trouve la raison nulle part.  [...] Ma question est donc. pourquoi la concentration de KCl dans un tampon est toujours plus faible que le NaCl Le KCl stabiliserait la protéine plus efficacement, et éviterait les interactions non spécifiques à concentration plus basse.  [...]

extraction des protéines par le Tris-HCl

Je suis à la recherche du rôle de la concentration du solvant Tris-HCl dans l'extraction des protéines dans le coeur de dinde (un tissu ) j'ai fait une manipulation d'extraction par le Tris-HCl 1M / 2M et 3M et j'ai trouvé les résultats suivantes.  [...] i) les premières données ne semblent pas indiquer de lien linéaire entre la concentration en tampon et la concentration en protéine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Impossible de récuperer ma protéine GST-X

je produit en Bl21 des protéines GST-X, la production a été mise au point et la protéine est bien exprimée. Lorsque je veux récuperer cette protéine, j'utilise un tampon de lyse contenant du lysosyme, Dnases ( avec MgSo4 et CaCl2) à de très forte concentration, il y a du triton, du chaps et une forte concentration en sels à 1M, tris-Hcl à pH8 mais je n'arrive en aucun cas à sortir ma protéine.  [...] - les cellules sont pas lysees. Pas besoin d'incuber tes cellules ON dans le tampon de lyse. Ca devrait aller plus vite que ca, en plus c'est pas top de garder des proteines si longtemps. Utilises un tampon tout bete Tris + lyzozyme a 37 deg 30' puis rajouter du SDS pour une concentration finale de 1%.  [...]

[Biochimie] Concentré une protéine recombinante

Pour concentrer les protéines, il existe des filtres de porosité donnée (je ne sais pas s'ils descendent en-dessous de 10 kDa), qui permettent d'éliminer la quantité voulue de tampon tout en retenant la protéine. On a donc bien une augmentation de la concentration de la protéine.  [...] Pour reconcentrer ta protéine et changer ton tampon tu peux comme il a été dit utiliser l'ultrafiltration si tu as dans ton labo le matériel nécessaire (Microcon, Centricon, Amicon, Vivaspin...).  [...]

Résultats | Dossier

Pour être sûr que les différentes isoenzymes soient présentes, un western blot est pratiqué avec l'extrait cellulaire pur (1), le pic correspondant au premier lavage de la colonne (2), celui supposé contenir la protéine kinase C (3) et un dernier avec un lavage fait avec le tampon additionné de chlorure de sodium à la concentration de 2 M (4) (fig.  [...] Pour le CED-28, nous pouvons observer que pour une faible concentration en composé, la translocation est conservée. Par contre lorsque nous utilisons une concentration plus élevée, nous notons une absence totale de déplacement de l'enzyme à l'intérieur des granulocytes neutrophiles, ceci est valable pour les trois isoformes (&beta.I,&beta.II et &zeta.) de la protéine kinase C.  [...]

Problème de migration SDS-PAGE

L'expérience consiste, dans un premier temps, à dénaturer les protéines dans de l'urée 8M + DTT 5mM, puis à les renaturer par l'utilisation d'un tampon (TrisHcl, NaCl et EDTA), une centrifugation est ensuite réalisée, le surnageant correpondant à ma fraction soluble est concentrée par evaporation et mon culot correspondant à ma fraction agrégée est resuspendu dans un peu de tampon de dénaturation (Urée 8M + DTT 5mM) et Laemmli Buffer 5X.  [...] il semble que j'ai résolu le problème qui n'était autre que l'urée... En effet je dénature avec de l'Urée 8M puis renature avec un tampon (TrisHCL, NaCL, EDTA) puis je concentre ma protéine par evaporation, l'urée reste donc à trés forte concentration à la fin de l'évaporation.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Que tu fasses une gel-filtration ou une echangeuse d'anion (surtout dans le deuxième cas en fait), la premiere chose à faire en sortie de colonne de nickel est de dialyser (eventuellement par concentration/redilution) ta protéine contre une solution contenant très peu de sel.  [...] Si tu fais une gel filtration, c'est simple, tu concentres ta protéine autant que tu peux (dans un volume inférieur à 100 µl de preference). Tu fais ensuite circuler dans la colonne ton tampon A, tu injectes la protéine et les protéines se séparent toutes seules en fonction de la taille (les plus grosses d'abord, les plus petites après), il n'y a plus qu'a recuperer les fractions et trouver dans lesquelles se trouve la protéine.  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Après une centrifugation à 400 g pendant 10 minutes à 4°C, les granulocytes sont remis en suspension dans le tampon de lyse de chromatographie (cf. annexe 1) à la concentration de 50.10 6 cellules/ml et à raison de 25.10 6 cellules par tube. Les cellules sont lysées par sonication, à raison 6 fois 5 secondes en prenant garde à bien refroidir les tubes entre chacune des phases de sonication pour éviter une dénaturation trop importante de l'enzyme.  [...] Les granulocytes neutrophiles sont dans du tampon Hanks'HEPES à la concentration de 5.10 6 cellules/ml et à raison de 25.10 6 cellules par tube. Deux incubations de 15 minutes chacune sont réalisées avec du PMSF à 57 µM, ceci pour limiter la dégradation de la protéine kinase C.  [...]

Sds-page

Je me demande si le SDS à un rôle différent selon sa concentration, ou son utilisation (en tampon ou en gel). Est -il possible qu'en plus de charger négativement les protéines, il les dénature plus ou moins suivant ces critères.  [...] En cas de westernblot on utilise souvent une concentration plus faible en SDS afin de l'éliminer rapidement au lavage et redonner une configuration native (ou presque) aux protéines.  [...]