• Santé - Concentration, Tampon, Glycine

[Biochimie] Sds page

Tu peux filtrer, mais ce n'est pas nécessaire (le SDS va tuer toute les petites bêtes). Le Tris a un pouvoir tampon fort, surtout à forte concentration, mais la glycine a aussiun pouvoir tampon (plus faible, certe). Si la concentration du tampon Tris que tu utilises dans ce gel est plus faible, cela peut induire des variations de pH (mais n'a pas d'impact sur la polymérisation normalement).  [...] Une concentration trop faible d'un des deux composants empechera la polymérisation. Si les solutions sont un peu (ou très) vieille, le composé actif est moins présent, et il faut en mettre plus. Je te conseillerai donc d'augmenter les concentrations finales de APS et TEMED.  [...]

les gels de compression et de sépartion

Pourquoi utilise-t-on un tampon tris avec des pH différents pour les gels de compression et de séparation en western blot.  [...] La différence de pH permet une vitesse de migration différente, une migration plus lente permet l'entrée dans le gel et la concentration des protéines. L'effet est lié au pI de la glycine du tampon de migration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Préalablement au transfert, j'équilibre ma membrane pendant 10 à 20 minutes dans le tampon de transfert et je laisse mon gel 30 min avec agitation dans le tampon de transfert pour enlever le SDS.  [...] Au début j'utilisais un tampon de transfert contenant 20% de Méthanol avec 25 mM de Tris Base et 190 mM de Glycine. J'ai entre temps diminuer la concentration de Méthanol à 10% et j'ai donc observé un meilleur transfert. J'ai aussi essayé avec des gel de 0.  [...]

trypsine Jaune...

nb. j'ai utiliser de la glycine pH2 car c'est ce qu'on utilisait dans mon protocole de purification mais pensez-vous que c'est mieux que je la conserve dans HCl 1mM avant de la congeler.  [...] Après, tout dépends de la concentration du tampon Tris et de la Glycine, mais si la glycine est plus concentré, le pH ne variera pas beaucoup.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

J'utilise une composition de gel tout ce qu'il y a de plus classique (10% acrylamide, 375 mM Tris 8.8, 0,1% SDS, 0,05% APS, Temed) pour le gel de séparation et (4% acrylamide, 125 mM Tris 6.8, 0,1% SDS, APS, Temed) pour le gel de concentration. Mon running buffer est un tris-glycine-sds mais je ne me rappelle pas de tête les concentrations.  [...] Certaines protéines notamment les plus grosses et les membranaires restaient alors piégées, elles restaient donc tout en haut du gel (dans le gel de concentration) et le WB était donc systématiquement négatif. Si tu es dans cette situation,tes échantillons doivent être fortement turbides et par ailleurs ils doivent extrêmement visqueux voire carrément pateux et le chargement doit être particulièrement difficile.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

Une question me taraude. vous voulez purifier des Ac pour les utiliser dans une colonne d'affinité. Mais selon votre procédure utilisant une sélection sur SDS-PAGE ne risquez vous pas de sélectionner des anticorps qui ne reconnaitrons pas la structure 3D de votre protéine Ce qui risquerait de poser quelques problèmes quant au rendement de votre purif par affinité sur colonne.   [...] en fait pour repondre a ta question, j utilise l'electrophorése dénaturante car ma proteine precipite en gel natif c'est une question de pHi.   [...]

[Immunologie] Analyse réponse humorale par ELISA

Pour la révélation, nous avons utilisé un anticorps secondaire couplé à la phophatase alcaline (AP) puis nous avons ajouté le substrat (PNPP) de cette enzyme. Jusque là tout va bien. Ce que je ne comprends pas, c'est pourquoi nous avons dilué le substrat dans du tampon diéthanolamine.  [...] je ne serais pas d'une grande aide mais le seul élément que je peux apporter à ta question c'est que le tampon diéthanolamine a remplacé le tampon glycine/NaOH car il s'est révélé plus efficace. En quoi Je ne sais pas.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

..alors je le refais avec du tampon de transfert tout neuf, je fais attention au bulle en roulant bien mon sandwich avec une pipette de 10ml...et résultat quasi identique. transfert moche.  [...] Apres activation, tu as mis équilibrer ta membrane dans le tampon de transfert (Les tampons de transfert doivent être à 4°C).  [...]

Problème de migration SDS-PAGE

Si les ratios étaient de 50% chacun, cela signifierait que votre Laemmli est à 2X. Si vous voulez préparer une solution de volume final de 10µL par exemple, il faudra ajouter 10/5=2µL de bleu de laemmli, et complétez jusque 10µL avec vos échantillons dilués à la bonne concentration.  [...] il semble que j'ai résolu le problème qui n'était autre que l'urée... En effet je dénature avec de l'Urée 8M puis renature avec un tampon (TrisHCL, NaCL, EDTA) puis je concentre ma protéine par evaporation, l'urée reste donc à trés forte concentration à la fin de l'évaporation.  [...]

[Biochimie] Pb échantillon gel Tris-Tricine

Une question stupide mais vous ne vous plantez pas en coulant votre gel Genre séparation au dessus, concentration en dessous. Ca ne m'est jamais arrivé mais pourquoi pas après tout.  [...] Il y a peut être un problème avec l'acrylamide mais ca fait deux fois qu'on obtient le même résultat snif... Pour ce qui est du gel de stacking et du gel de concentration, on les coule successivement et en se réferant au protocole donc pas de pb de ce côté là.  [...]