• Santé - Colonies, Bac, Région, Intérêt

Isoler une région d'un génome à partir d'un BAC

Le probleme du criblage de BAC par PCR viens notamment du tres grand nombre de clone que tu vas devoir repiquer et analyser en PCR. ca va etre long. Une technique plus rapide et tout aussi efficace est d'effectuer une replique de tes colonies sur une membrane et d'effectuer une hybirdation avec une sonde radioactive (ou froide) spécifique de ton gène d'interet.  [...] Cela va deja te permettre d'identifier les colonies possédant un BAC avec ta region d'interet. Ensuite seul le sequençage te permettra de t'assurer que tu as l'integralite du gene recherché, car comme il proviens de la souris tu travailles tres probablement avec une banque de BAC contenant du cDNA et tu n'es jamais a l'abri de problemes techniques lors de la reverse transcription (ou que tu ARNm soit epissé alternativement, ou possede plusieurs initiation/termination transcriptionelle.).  [...]

Criblage

Dans la synthèse de l'insuline in vitro par exemple, on effectue un criblage des colonies blanches obtenues après ensemencement sur un milieu contenant le lactose. On rechercher les bactéries ayant un plasmide contenant le gène recherché mais le fait que ces colonies soient blanches, cela veut dire pas d'expression du gène de la beta-galactosidase et donc insertion du gène d'intérêt non.  [...] Si une colonie pousse, c'est qu'elle a bien reçu un plasmide. cet événement est séléctionné par un gène de résistance à un antibiotique présent dans le milieu.  [...]

plasmide pcDNA3 et mock??

Le plasmide pcDNA3 est ce qu'on appelle un plasmide vide, c'est à dire qu'il contient tout les éléments d'un plasmide classique (promoteurs, gène de résistance, origine de réplication...) mais pas de gène d'intérêt. Il est utilisé comme témoin négatif lors de transfections (transfection de matériel génétique mais pas d'expression de gène) ou comme témoin positif lors de transformations bactériennes (formation de colonies grâce au gène de résistance).  [...] Cela sert à voir si il n'y a aucun élément pouvant fausser les résultats dans le milieu de transfection/tranformation ou dans les cellules/bactéries.   [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

J'ai testé les différentes propositions que vous m'avez faites. J'ai pu obtenir des colonies ce matin. Seulement, il y a un souci, j'ai des colonies dans ma transformation témoin (bactéries transformées avec le vecteur ligaturé sur lui même). Je vais prendre le pari ce matin et essayer de faire des PCR de colonies pour voir si les fragments d'intérêt on bien été cloné.  [...] j'ai fait des recherches sur le kit in-fusion. Je pense que je l'utiliserai bien en dernier recours. Avant tout j'ai pas envie de laisser tomber aussi facilement sans savoir ce qui cloche. Aussi j'ai une autre question qui va d'une observation. A chaque fois (plus de 10fois) que j'ai fait des ligations vecteur d'expression pET45b + inserts d'interet (1330bp, 1894bp et 958bp) après transformation des Top10 puis étalement sur boite j'obtient toujours moins de colonies bactérienne dans la transformation effectuée avec l'insert de 1894bp quand bien même j'ai mis la même quantité de vecteur dans chaque produit de ligation.  [...]

[Biochimie] Problème de transformation

Pour savoir ce que c'est qui pousse... des colonies transparentes, aucune idée. mais ca peut être des contaminant. certaines bactéries peuvent développer rapidement une résistance à la kanamycine, surtout dans un labo ou cet antibio est utilisé couramment.  [...] D'où l'intéret de toujours vérifier que les colonies que tu isoles sont résistantes en raison de la présence du plasmide, et non d'une mutation spontanée. Ceci dit, si tes bactéries 'transparentes' ne poussent pas quand tu les repiques, ca veut dire que c'est des faux positifs.  [...]

[2nde] L'ADN...

Moi je pense que ce type de marqueurs fluorésents permettent de mettre en évidence les bactéries mutées, c'est à dire celles qui ont réçues le gène d'intérêt, ce qui permet aux scientifiques de les retrouver plus facilement. Fait attention à mon avis c'est pas des bactéries que tu vois dans les boites mais des colonies de bactéries, si ça pas une image de microscopie bien sur.  [...] Selon moi, il n'y a aucun rapport avec la croissance des bactéries et le nombre de colonies. Ces informations sont juste là pour dire que a protéine n'affecte pas la multiplication bactérienne.  [...]

Mélanomes

On peut ainsi voir l'aspect mutagène (changement de couleur de la colonie) ou finalement létal de certains UV... l'action protectrice des vitres... l'intervention du temps d'exposition... bon, il y a là un aspect expérimental.  [...] Après action des UV, non seulement certaines mutations sont létales, mais d'autres sont à l'origine de colonies de couleur blanche... L'intérêt est que l'on voit bien qu'il s'agit d'une mutation transmise de générations en générations puisques les levures forment alors des colonies blanches.  [...]

Microbiologie

Tu obtiens des colonies pures apres plusieur etapes d'etalement sur divers milieu selectif, et pour verifier qu'au final il te reste plus qu'une seule souche de bacteries tu etale ta colonie sur un milieu non selectif, si tu obtiens alors uniquement des bacteries de ta souches d'interet.  [...] Ouai de toute façon on peut voir le problème sous différents angles. Pur ne signifie rien en soit car rien ne peut être parfaitement pur en soit. qui nous dit qu'il n'y a pas des bactéries contaminantes en suspênsion dans l'air de la boite de Petri qui vont se déposer sur l'une des colonies.  [...]

[Biologie Moléculaire] Colonies de bactéries

Pour en arriver a ma question. j'ai étalé les bactéries sur des boites LB-Agar-Antibio, j'ai fait des prep sur 12 colonies. J'ai testé la bonne insertion de mon ADN dans le BAC par PCR (avec des primers designés spécialement). Le problème est que j'ai tout et n'importe quoi.  [...] Cela me donne l'impression que mes colonies sont hétérogènes et contiennent différentes populations de bactéries. Est ce donc possible qu'une colonie récupérée sur un milieu LB Agar ne soit pas pure.  [...]

[Biochimie] Gateway technologies

TU places ton fragment dans l'entry clone et tu étale ça sur LB-kanamycin. La réaction provoque l'xcision du gène ccdb, léthal pour tes bactéries, donc les colonies que tu vois pousser ont forcément eu le ccdb excisé, donc ton ADN à la place -. Proficiat.  [...] D'où l'intérêt de la sélection successive kanamycin ampicilline, ça t'évite de te retrouver à la fin avec des colonies portant ton Donnor vector, dont tu te fiches après la LR.  [...]