• Santé - Colonie, Extraction, ADN

[Biologie Moléculaire] Bandes d'ADN non amplifié??

La réponse la plus simple est que ces souches n'ont pas le fragment d'ADN que tu essaies d'amplifier. Quelle type de molécule supporte ce fragment (chromosome, plasmide) Est-ce une PCR colonie ou sur une extraction Il peut aussi s'agir de la présence d'inhibiteurs de PCR dans les extractions d'ADN des souches qui semblent négatives.  [...] Merci d'abord pour ta réponse, c'est vrai que l'amorce est incompatible, c'est une possibilité, c'était une RAPD, il s'agit d'ADN total extrait, et le problème c que d'autres souches sont négatives sans monter cette bande d'ADN.  [...]

identification bactérienne en qq heures

Seulement comme tu le vois ces techniques ne permettent certainement pas une identification absolue.On connait ou suspecte par avance ce que l'on cherche.(exemple ziehl nieslen n'est pas spécifique de M.Tuberculosis,mais avec la clinique et des radios à côté on peut le suspecter fortement).   [...] En effet, comme il l'a déjà été dit, il faut savoir quelle espèce on recherche, un peu comme un test par immunodetection. De plus les conditions de PCR directement sur colonie ou milieu liquide (sans extraction d'ADN) sont souvent variables d'une espèce à l'autre.  [...]

plasmide-clonage

aprés avoir rendu les bactéries compétantes et les avoir coupé avec des enzymes de restriction, on peut faire rentrer la molécule d'adn dans les bactéries, ensuite il faut repérer les bactéries ayant reçu ce géne.  [...] En général (hors système Bleu-blanc de la B-Gal), on extrait l'ADN des colonies ayant poussé (miniprep. on pique une colonie, on la fait pousser en culture une nuit dans un milieu liquide contenant l'antibiotique en question, puis on la casse et on purifie son ADN) et on coupe l'ADN avec des enzymes de restriction pour déterminer quelle colonie possède le fragment d'intérêt (on dit alors que la colonie est un clone positif ) et l'ADN de cette colonie est alors amplifié par Midipreps pour être utilisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : migration après amplification (sans digestion enzymatique)

Je dispose de deux colonies bactériennes une blanche et une bleue (ayant donc subi un criblage blanc-bleu) donc une ayant intégré l'insert au niveau du polylinker et l'autre non. Le plasmide originel faisait 3900 pb et l'insert 240. J'en déduis donc qu'une colonie blanche a un ADN de taille 3900+240 soit 4140 pb et une bleue de 3900 pb.  [...] Là je ne suis pas sure de moi du tout. est-ce que pour la colonie bleue il n'y a pas de produit d'amplification et pour la colo blanche il y en a un de 240 pb Je trouve ça illogique car la PCR amplifie l'ADN, or la colonie bleue même sans insert contient bien un plasmide donc de l'ADN.  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

Ma prochaine étape est donc de récupérer une ou plusieurs colonies (je pense 4) et de les laisser se développer dans un milieu LB. Quelle est la prochaine étape pour pouvoir utiliser correctement mon ADN pour une PCR afin d'amplifier mon gène.  [...] Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...]

utilisation des résistances aux antibiotiques

Euh pourquoit tu veux faire ca Ta bactérie transformée, tu la sélectionnes sur boite de Pétri et théoriquement si tu as bien travaillé, (admettons que tu as travaillé avec E.coli) tu n'as sur ta boite que des E.Coli transformée et non-transformée.   [...] au cours de la transformation bactérienne ( E.coli avec un plasmide ) quelle est l'origine des colonies apparues sur milieu sélectif.  [...]

[Biologie Cellulaire] transfection

le séquençage étant bon, je pouvais à pr ésent transfecter mes cellules, et donc j'ai pr éparé des midipreps pour transfecter et là je découvre que je n'ai rien, mon stockage devait être mauvais ou pour une autre raison que j'ignore, mes bactéries ne servaient plus à rien, tout ce que j'avais c'était mes minipreps de départ, alors j'ai lancé ma transfection avec mes minipreps, sachant que le protocol d'extraction des mini differe de celui des midi je ne sais pas ce que ça va donner y en a t il parmis vous qui s'y connaissent.  [...] En fait, on peut parler de prep... Cela va de la micro à la giga (ou plus peut-être). En fait, c'est juste pour donner une idée de la quantité d'ADN que l'on souhaite récupérer. A ce jour, les micro n'existe plus, on réalise à la place une PCR sur colonie ou demi-colonie (plus rapide).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

ma ligation est optimisée (sur la nuit), rapport vecteur/insert 1.10. mes bactéries sont compétentes108B/µg ADN. après transformation, aucune colonie.  [...] après dépos sur gel le signal raltif à mon fragment d'interet reste faible (rapport incorrect avec l'autre fragment )mais les bandes plus visibles pour faire l'élution des bandes(kit gel extraction). j'ai déposé un aliquot à la fin d'élution j'ai eu encore un signal très faible (21ng/µL).  [...]

a l'aide : double hybride en levure!!!!

Alors l'efficacité de transfo est le nombre de colonie sur la boite obtenue avec 1 microgramme d'ADN. En général on se situe aux alentours de 10 4.  [...] Exemple.J'ai transformé 15 µg de ma banque avec 5 µg de mon plasmide appât. j'ai donc Q = 5. J'ai resuspendu ma co-transfo dans Vtot = 10 mL. J'ai pris 1 µL de la co-transfo, que j'ai mis dans 99 µL de milieu adéquat. ça me fait donc une dilution au 1/100 que j'étale sur ma boîte de Petri (en schématisant rapidement).   [...]

[Biologie Moléculaire] L'ADN plasmidique

Salut,afin d'extraire l'ADN PLASMIDIQUE un groupe de travail a inoculé 5ml de bouillon LB à partir d'une colonie isolée sur milieu gélosé ils ont incubé ce bouillon une nuit à37°C.  [...] pour préciser ma pensée, c'est la lyse alcaline qui peut induire des coupures de l'ADN, ce qui, selon les applications, peut être problématique. Notamment dans le cas des purif sur chlorure de césium (de mémoire, mais là ca remonte à loin..).  [...]