• Santé - Clones, Fragment, Plasmide

[Biochimie] Purification post PCR

j'aurais voulu connaitre une methode qui, à l'issue d'une PCR avec TAq permet de purifier les amplifiats obtenus en écartant ceux qui possèderaient d'éventuelles erreurs.   [...] Après, si tu clones ce fragment dans un plasmide, il faudra amplifier individuellement des clones après transformation et vérifier ta séquence par séquençage.  [...]

génie génétique

Bonjour à tous, lorsque l'on veut insérer un fragment de restriction dans un plasmide pour pouvoir produire des clones, si ce fragment a 2 extrémités identique il pourrait se combiner avec extrémité du plasmide dans un sens aussi bien que dans l'autre alors comment grâce à enzyme de restriction peut-on choisir dans quel sens on veut que ce fragment se positionne.  [...] On peut choisir de fabriquer un fragment dont chaque extrémité présente un site de restriction différents ET qui sont aussi sur le plasmide, comme ça le fragment ne pourra s'insérer que dans un sens qui est celui sur le plasmide de clonage. ok.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

- plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens (ce qui est en réalité après vérification par pcr et par digestion ne contenant pas du tout mon insert) = entre 10 et 20kb.  [...] -plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens et digéré avec sacI lors de la vérification = toujour entre 10 et 20kb mais un peu derrière du même plasmide non digéré (ceci est valable pour toutes les 4 clones).  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

après criblage j'obtiens des clones mais une PCR à l'aide d'amorces spécifiques de mon fragment montre qu'il n'y a pas d'insert dans le plasmide.  [...] Sinon une purification sur gel après la digestion peut permettre de savoir si la digestion a bien eu lieue (mettre le produit non digéré et digéré sur un grand gel d'agarose 2% que tu fait migrer sur la nuit a ~ 60 V ça permet d'avoir une assez bonne résolution pour les fragments de cette taille).  [...]

clonage

J'ai fait pas mal de clonage de gros fragments, issus de PCR dans parfois de très gros plasmides, et parfois des plasmides arrangés maison (un bon vieux bluescript avec un oligo pour ajouter des cassettes GFP et un MCS), je n'ai pas eu de trop gros problèmes, à part murphy.  [...] Slt, alors oui amplification avec bon rendement du fragment désiré. purification ok avec un bon rendement égalment. Ensuite on a digéré le fragment PCR et notre plasmide avec les memes enzymes. On a testé différentes choses mais rien n'y fait. On n'obtient pas de clones satisfaisants.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Non, je ne vais pas transformer Agro avec une construction pBSK, mais avec une autre construction sur le plasmide T qui contiendra le fragment que j'aurai amplifié sur E. coli. Ce plasmide servira ensuite à transformer mes plants.  [...] Ce que tu peux faire aussi, c'est du Tcloning. Tu amplifies ton fragment, tu purifies sur gel et tu clones direct dans un plasmide. Ensuite tu reutilises ce plasmide comme template pour faire une PCR qui marche du feu de dieu et avoir 2 Kg d'insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

LA seule solution trouver est de sous cloner ton fragment dans un plasmide (genre pBC-SK) à un site franc. C'est simple et rapide car tu as une selection bleu /banc. Ensuite tu ressors ton insert par HindIII et tu le clones dans ton plasmide final.  [...] Refait le clonage à partir de ton fragment sorti de PCRTopo mais sans déphosphorylé ton plasmide. La CIP ou la shkink abime parfois les extrémités de l'ADN rendant impossible toute ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...] - plasmide + ligase...= temoin de religation = plasmide digere mais mal dephosphoryle va se religuer sur lui-meme = integrera les bacteries = presence de + de clones (plasmide non digere + plasmide mal dephosphoryle).  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Dans ce plasmide, on veut cloner au site EcoRI un fragment d'ADN génomique de Salmonella portant le gène neoA (homologue à Salmonella) et qui confère une résistance à la néomycine.  [...] Les clones vides sont résistants alors que les clones+ plasmides ont perdu cette résistance (on a cassé le gène en insérant notre fragment). Par comparaison on retrouve nos clones intéressants.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique SELEX aidez moi!

3. On disposent de fragments qu'on espère pouvoir exploiter pour obtenir la séquence consensus. Ce que l'on va faire c'est simplement un clonage des fragments. Des colonies seront piquées, amplifiées puis séquencées. L'analyse de toutes les séquences nous donnera la séquence consensus.  [...] Pour cela vous allez prendre votre éluat et vous allez mettre vos fragments dans des plasmides et les cloner en bactéries. Chacune des bactérie porte un clone qui lui même porte un fragment. Ainsi vous séparez vos différents fragments. Il ne vous reste plus qu'a reprendre vos clones, extraire les plasmides et les séquencer un par un.  [...]