• Santé - Clonage, Protéine, Intérêt

Antigène

Les protéines recombinantes ne sont donc pas extraite de la nature mais synthétisées en laboratoire. Pour te donner un exemple que j'ai expérimenté, moi en thèse je travaillais sur la protéine d'un parasite très pénible à cultiver. J'aurais jamais pu cultiver assez de parasites pour ensuite faire 50 étapes d'extraction/purification pour arriver à un excellent taux en ma protéine d'intérêt dans mon échantillon, et en quantités acceptables pour mes manips.  [...] Du coup, j'ai fait exprimer ma protéine d'intérêt à une bactérie (E. coli). elle se cultive très facilement et je peux lui faire produire ma protéine en très grande quantité. C'est ce qu'on appelle le clonage moléculaire. Grâce à la transgenèse. Après expression de la protéine, je dois la purifier pour me débarrasser de tout ce qui appartient à la bactérie et me retrouver avec un taux idéalement avoisinant 100% de ma protéine d'intérêt.  [...]

[Biochimie] iddées d'actualité

je travail sur un clonage du géne codant pour une proteine d interet dans pichia dans mon master et il me faut un autre sujet pedagogique.  [...] je voudrais un sujet un peu d'actualité pour faire se rapport.   [...]

Méthode de marquage - HaloTag

Si j'ai bien compris la brochure, en gros au lieu d'avoir une GFP comme protéine de fusion, c'est le Halo tag qui est couplé à la protéine d'intérêt. Le principe a l'air assez simple, en gros on peut ensuite coupler n'importe quoi sur le Halo (billes, biotine, fluorophore.  [...] ..). Ce qui fait qu'on peut l'utiliser pour localiser la protéines d'intérêt dans un tissu ou une cellule avec la fluo, mais aussi coupler avec des billes pour faire un réaction biochimique, ou encore fixer la protéine sur une lame de verre, le tout sans devoir recommencer le clonage à chaque nouvelle application.  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

De plus je valide mon Master 1 sur ce projet, et j'ai deux semaines de laboratoire libre pour le réaliser. Connaissez-vous une autre protéine membranaire qu'il serait possible de cloner et d'exprimer avec des résultats corrects.  [...] Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr/clonage

Est ce qu'on fait la PCR apres avoir inseré les fragments d'intérets dans les vecteurs,ou est ce qu'on amplifie par PCR les fragments d'intérets qu'on insere ensuite dans le vecteurPour moi la PCR est une technique de clonage,donc si on connait la séquence qu'on veut cloner,une PCR est suffisante,il n'y a pas besoin d'utiliser de vecteurs apres.  [...] La PCR va permettre d'isoler et amplifier un fragment d'intérêt qui va ensuite être intégré dans un vecteur. Lorsqu'on fait un clonage ou un sous-clonage, on souhaite exprimer ce fragment qui dans la plupart des cas correspond à l'ADNc codant une protéine ou une partie de la protéine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Questions sur clonage

1/De quoi dépend le choix d'un hôte de clonage qu'il soit procaryote ou eucaryote est-ce sa capacité d'insérer des fragments longs.  [...] 1/ le choix de l'hote de clonage depend en partie de la cytotoxicité de la protéine resultant du gène d'interet. Certaine protéine seront toxique pour un procaryote et donc il n'y aura aucune utilité a cloner le gene dans un procaryote.  [...]

[Biochimie] Expression protéique

Je réalise un clonage hétérologue d'une protéine (VapA).Le gène codant ma protéine d'intéret est exprimé (étude ARN ok) mais le problème est qu'elle est indedectable que ce soit au sein de la bactérie (Mycobacterium marinum) ou du surnageant en Western blot.  [...] Dans les deux derniers cas, la situation peut etre rattrapable en bactérie. Si ce qui t'intéresse, c'est de produire la protéine pour l'utiliser ensuite dans diverses manipes, passe en E. Coli et privilégie la souche Rosetta qui est particulièrement adaptée à ce genre de cas.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur de clonage et le vecteur d'expression

Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel on va cloner le même fragment d'ADN après vérification du clonage dans le vecteur de clonage (taille de l'insert, séquence...) et grâce à son promoteur (constitutif ou inductible) ce vecteur va diriger la bactérie hôte d'expression pour produire la protéine d'intérêt.  [...] I) Définition des vecteurs. Petites molécules d'ADN possédant leur propre système de réplication. Ils servent de véhicule pour le clonage génique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

PinPoint contient un promoteur tac de transcription suivi de la séquence d'un tag-Xa. Le tag est un petit peptide qui permet de purifier la protéine indépendamment de la protéine d'intérêt, il est suivi de Xa qui est une protéine qui peut être clivée et permet de donc de retirer le tag après purification pour n'avoir plus que la protéine native.  [...] On trouve derrière la cassette de clonage pour insérer votre protéine d'intérêt. C'est donc un vecteur de choix pour la production (il porte un promoteur de transcription) et la purification (un tag excisable) des protéines.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

A quelle étape intervient le sous clonage lorsque l'on constriut une banque d'ADNc est-ce uniquement lors de l'exision du gène d'intérêt où la construction de la banque elle même passe par un sous clonage je suis un peu perdue.  [...] La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) où bien quel est l'intérêt de la banque.  [...]