• Santé - Clonage, Intérêt, Enzyme

Vecteur de clonage, PCR et vecteur d'expression

Voilà, peux t-on faire une PCR sur un vecteur de clonage comportant le gène d'intérêt c'est pour le clonage d'une enzyme. Ils parlent de strands (anglais) de plasmides qui ont été amplifiés par PCR dans un premier temps mais je ne sais pas si c'est possible directement sur un vecteur de clonage Le gène d'intérêt est lié au gène GST (gluthation transférase).  [...] Ouaip justement, l'enzyme interagit avec son substrat. Il me semble que le probleme posé est sur le clonage de l'enzyme. POur savoir si l'enzyme a parfaitement ete cloné on prend l'extrait que l'on a obtenu suite aux experiences de PCR pratiquées et on pratique un double hybride avec cet extrait couplé au Db et le substrat couplé au AD.  [...]

[Génétique] phage

bonsoir. J'espere que quelqu'un saura m'éclairer. la partie centrale des phages peut etre utilisée comme vecteur de clonage. mais, est ce qu'on retire cette partie pour la remplacer par un adn d'intéret, ou est ce qu'on enleve seulement quelques morceaux pour en faire des sites de restriction d'une enzyme de restriction spécifique, et alors l'adn que l'on veut cloner serait ajouté dans la partie centrale.  [...] mais, est ce qu'on retire cette partie pour la remplacer par un adn d'intéret, ou est ce qu'on enleve seulement quelques morceaux.  [...]

Clonage orienté

Je suis bloquée, j'ai un peu de mal avec les enzymes de restrictions et je comprend pas tout à fait ce que l'on me demande. Sachant que l'on veut un clonage orienté, on me demande de choisir les enzymes de restrictions utilisable du côté de la bordure portant la séquence du promoteur T7 sachant que le fragment d'intérêt contient un site SacII.  [...] Si c'est bien le cas, cela signifie que tu ne peux pas utiliser SacII pour le clonage. En effet, le clonage va consister à amplifier ton insert avec des oligos de PCR portant des sites de digestion aux enzyme de restriction voulues. On ne veut donc pas que la digestion en question coupe ton insert en deux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

A quelle étape intervient le sous clonage lorsque l'on constriut une banque d'ADNc est-ce uniquement lors de l'exision du gène d'intérêt où la construction de la banque elle même passe par un sous clonage je suis un peu perdue.  [...] La méthode que Delirium m'a gentiement indiqué permet directement une sélection spécifique de l'Adnc avant clonage puisqu'on utilise des amorces spécifiques lors de l'amplification mais la sélection des clones d'intérêt au sein d'une banque d'adn na se fait-elle pas ensuite (une fois la banque construite) par criblage (hybridation avec une sonde specifique) où bien quel est l'intérêt de la banque.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sous-clonage et taille des fragments

je sollicite votre aide pour résoudre mon problème. Suite à un sous clonage, mon insert d'intérêt (environ 0.42kb) à été intégré dans un vecteur (3.6kb)... soit une taille totale après sous clonage de 4.02Kb. Après test de différentes colonies (9 en tout) et digestion de mes plasmides (double digestion enzymatique. XhoI / NcoI)...le résultat sur gel donne ceci.  [...] Mon fragment d intérêt de 0.42Kb est présent pour les conditions n°2 - 5 - 6 et 9...mais la taille du vecteur ne corresponds pas (il fait entre 2 et 2.5Kb au lieu de 3.6Kb).  [...]

clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

Mon encadrant m'a donc dit de refaire une digestion contrôle en prenant une enzyme en dehors du site de clonage multiple (MCS) mais je ne vois pas à quoi cela va servrir.  [...] Il se peut que ton MCS ait été enlevé au cours du clonage (c'est normalement peu probable si tu as bien designé ton clonage). Il se peut également que le plasmide de départ soit muté et ne possède pas certains sites de restriction (également assez peu probable).  [...]

[bio mol] pUC et LacZ

Sur le plasmide pUC, on a donc le gène LacZ. Quand on fait le clonage, on va faire en sorte que le gène d'intérêt s'intègre dans le plasmide AU MILIEU du gène LacZ.  [...] S'il n'y avait qu'un seul site de clonage, tu aurais une grosse contrainte sur ton ADN de départ et donc presque jamais la possibilité de le découper pour en isoler ton fragment d'intérêt (ou alors, tu aurais à l'amplifier avec de amorces portant le site de restrictions, ce qui est plus lent et peut génerer des erreurs).  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs navette

Vecteur de clonage. est un plasmide ayant une réplication autonome dans la cellule hôte et un site multiple de clonage afin de cloner un fragment d'ADN d'intérêt.  [...] Il me semble, d'après mes souvenirs, qu'il s'agisse de vecteurs possédant plusieurs origines de réplications leur permettant de se répliquer à la fois dans les bactéries et dans les cellules eucaryotes.   [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

Ma question du jour, c'est de savoir le mecanisme d'action d'une ADN ligase en général et dans mon cas pour le clonage d'un géne d'interet dans un plasmide (PICZ) qui sont les deux digérés par les mémes enzymes de restriction (SFII et NOTI).  [...] Ceci dit jusque la je compte pas trop sur le clonage avec l insert issue de la digestion du produit PCR parceque j ai des constructions deja faites par des etudiants qui ont passé jadis par le labo à savoir le plasmide PLIP6-P30 et le PET22b(+)- P30 et donc je recupére mon gene d interet qui code pour la P30 à partir de ces constructions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

- un premier intérêt est celui que tu dis. tu n'utilises pas d'enzymes, pas besoin de choisir 2 enzymes différentes, de déphosphoryler le plasmide, phosphoryler les primers...ect... une simple PCR suffit pour l'obtention de ton gène avec les séquences nécessaires à l'introduction dans le plasmide.  [...] -les passages du gène d'intérêt dans le premier vecteur et le passage du premier vecteur au second, ne nécessitent pas d'amplification PCR avec la Taq... donc pas d'incorporation d'erreur de nucléotide par cette enzyme.  [...]