• Santé - Cellules, Localisation, Protéines, Anticorps

[Biologie Moléculaire] Quelle stratégie adopter?

Pour se faire j'ai construis deux vecteurs, le  [...] contient un promoteur fort puis la PG1 et la GFP et le deuxième contient un promoteur fort puis la SIRT1 puis la luciférase je réalise un BRET en excitant la luciférase avec coelenterazine j'ai donc fluorescence de la GFP j'ai donc bien montré l'interaction or le professeur me demande de faire un test de localisation puis un test de fonction de la proteine endogène pour cela est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différenteet pour la fonction je ne sais pas dutout d'autant plus qu'il faut savoir si la proteine chimerique modifie les fonctions endogènes de la proteine pour ca je netrouve pas de strategies.  [...] est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différente.  [...]

[Biologie Cellulaire] Compter les passages

je travaille actuellement sur des cellules HEK. J'aimerai savoir comment sont comptabilisés les passages Logiquement, on devrait repartir de P0 lorsque l'on décongèle un lot mais je ne suis pas sur que cela marche comme cela - j'ai lu un travail (Luo et coll, 2005) qui parle de l'extinction de certaines protéines avec le nombre de passage.  [...] Si tu as des anticorps dirigés contre ta protéine, tu peux faire une IF pour regarder le % de cellules exprimant ta protéine au cours des passages. Cela te permettra aussi de voir la localisation de ton récepteur qui peut éventuellement varier.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage par Ac-FITC : du solide ?

Après la période d'incubation, j'aurais ajouté un anticorps anti-[protéine récherchée]. puis un second anticorps marqué au FITC et dirigé contre l'anticorps du complexe précédent.  [...] je ne pense pas que tu aies le choix. Quelle est la localisation cellulaire de ta protéine En immuno généralement on fixe les cellules puis on les perméabilise pour donner accès aux anticorps. Autre chose. ce type d'approche n'est que peu quantitatif.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunofluorescence sur cellules surnageantes

En ce moment au labo, j'essaye d'obtenir une co-localisation de deux protéines par immunofluorescence dans des cellules leucémiques. Le problème est que le cytospin utilisé pour attacher les cellules sur une lame déforme les cellules. Le noyau a une forme correcte mais dans le cytoplasme, mes protéines ne localisent pas de manière précise comme c'est le cas pour des cellules adhérentes.  [...] Aussi, une publication d'une équipe anglaise attache ces cellules à la lamelle en déposant 30 µl de suspension cellulaire sur la lamelle puis en la faisant sécher à l'air, suivit de la fixation au PFA. C'est assez original. Cependant, dans tous les cas je ne trouve pas leur images prises au confocal très jolies, les localisations protéiques ressemblent plus à des amas flous qu'à des points bien focalisés.  [...]

evaluation de l'immunogénicité

Isolation de ladite proteine et injection sur différentes espèce à différentes concentrations et observer les résultats (production d'anticorps, effets sur différents organes éventuel).  [...] Eventuellement pour la localisation, tu produis des anticorps et tu fais une immunofluorescence sur des cellules d'interêts.  [...]

[Biochimie] Identification et caracterisation de protease

Je sais que j'ai une ou plusieurs protease dans mes cellules qui clivent une proteine virale de fusion. Je sais que cette/ces protease est intracellulaire et apparement soluble.  [...] Pour les anticorps, tu ne peux pas t'aider de sa capacité à cliver les protéines virale de fusion pour connaitre un peu comment est sa structure et trouvé un anticorps qui puisse être complémentaire à celui-ci (tu pourrais ainsi vérifier par immunomarquage si cette protéine est bien celle que tu cherche par sa localisation intracellulaire ^^).  [...]

AIDE :sos: : les techniques d'étude en biologie

l'histologie est une étude morphologique d'un tissu (formes cellulaires, densité, etc...) puis tu descends dans les échelles avec la cytologie (étude des cellules, formes). enfin, l'autoradiographie te permet de visualiser la présence et la localisation d'une molécule en particulier, que tu auras préalablement marquée par un anticorps ou un élément radioactif.  [...] pour l'autoradiographie, une molécule radiactive (anticorps radiomarqué fixé à la protéine cible, atome radioactif incorporé dans ta molécule cible) emet un rayonnement qui noircit la pellicule photo. Développé dans le noir, seul la présence des éléments radiactifs sera visible sur la photo.  [...]

determiner la localisation subcellulaire d'une proteine végétale

1) Je pense qu'on peut co-transformer avec d'autres proteines dont on connais la localisation subcellulaire, en la fusionnant avec un autre fluorochrome.  [...] Une fois que tu as fait ca si tu as besoin d'une localisation plus précise, alors le mieux est l'immunofluorescence en utilisant des anticorps reconnaissants des protéines présentent spécifiquement dans les différents compartiments.  [...]

[Biologie Cellulaire] Leucine radioactive

Des cellules sont mises en culture dans un milieu nutritif contenant de la leucine radioactive. La leucine radioactive va etre incorporée dans la cellule et cela permettra de suivre la localisation de cet acide aminé dans la cellule. La leucine est un acide aminé qui rentre dans la constitution de nombreuses protéines.  [...] Le mot était exportées. Les protéines qui passent par le RE finissent à la surface des cellules au niveau de la membrane cytoplasmique, et d'autres sont sécrétées directement dans le milieu extracellulaire. C'est donc à ces endroits que tu trouveras la radioactivité, et surtout au niveau de la membrane plasmique.  [...]

[Biologie Cellulaire] Mise en évidence de protéines membranaires

Bonjour, je suis actuellement bloqué sur une démonstration de la localisation des protéines (si elles sont transmembranaires ou périphériques) il est marqué dans mon cours.  [...] Tu auras donc d'autres techniques pour les autres cellules telles que la cryofracture (pour la localisation et la mise en évidence), l'électrophorèse des protéines membranaires solubilisées (pour la taille et le nombre d'unités,...), la modélisation (fonction, structure qui peut être un indice sur la nature de la protéine (plus d'hélices alpha et de feuillets béta chez les P trans-membranaires...),  [...]