• Santé - Bandes, Digestion, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Problème transfo...

Et même si je refais la digestion pour la 2e fois aujourd'hui, j'ai une fâcheuse permanence dans les résultats. Je prends toujours mini 10 clones de chaque transfor (ici, 2 transfos, donc 20 clones ont donné leurs plasmides pour la sciences ) et je me retrouve avec exactement les mêmes bandes (même PM et même intensité) à la fin.  [...] En fait, je n'ai jamais pensé à faire de simples digestions peut-être parce que jusque là je n'ai fait que des clonages simples = sans soucis et particularités... Ceci dit, vu la tête de ces digestions, je doute fort qu'une PCR soit utile. il n'y a pas mon plasmide dedans, déjà quand je pense aux intensités des bandes (celle à 2,5 kb est systématiquement beaucoup plus intense que celle à 5-6 kb, donc j'ai une quantité beaucoup plus grande de cet ADN, alors que je m'attendais quand même à des bandes d'intensités très similaires puisque je suis en équimolaire).  [...]

[Biochimie] Restriction bizarre

- pourquoi n'avons nous pas obtenu les meme bandes, lorsque le plasmide n'a pas été soumit a une restriction (piste 1 et 4) alors que les conditions été iden,tiques et le plasmide censé etre le meme.  [...] Combiend e site de coupe a le plasmide pour chaque enzime je pense a 2 pour BGIII au vu des résultas dans les pistes 2 et auncun pour PVUII (vu que le plasmide migre a la meme hauteur que le plasmide mon pote sans digestion) Cela voudrtait dire que les bandes dans les pistes 2 et 3 correspondent au plasmide linéarisé mais pourquoi n'ont -ils pas migré à la meme hauteur.  [...]

électrophorèse sur gel d'agarose

J'ai eu les résultats de la digestion et j'observe dans chaque cas 2 bandes. pour le plasmide non digéré j'ai une bande claire puis une bande foncée. et pour le plasmide digéré, j'ai d'abord la bande foncée puis la bande claire.  [...] Pour le BET c'est bien le cas, je suppose que c'est pareil pour les autres intercalants de l'ADN. Par contre cette relation marche t'elle que pour les fragments linéaires Une bande correspondant a un plasmide surenroulé ne devrait-elle pas être moins intense du au fait que certaines bases de l'ADN soit inaccessible du a la topologie de l'ADN ou alors est-ce négligeable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] On arrive enfin à ma question. comment je pourrai faire pour améliorer la discrimination de mes bandes sur mon gel J'ai testé de passer de 1% d'agarose à 0.8%, c'est un peu mieux mais pas mirobolant. Des idées Sachant que je fait migrer 5min à 70V puis 25/30min à 150V. Si je diminue le voltage, ça sera mieux.  [...]

[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

La digestion te donne des fragments d'ADN. L'electrophorèse les classe selon leur taille. Le résultat du gel d'electrophorèse te donne donc seulement des bandes, chaque bande correspond à des fragments de plasmides d'une taille donnée.  [...] Tu en déduis qu'il y a eu 5 fragments issus de ta digestion donc 5 sites sur ton plasmides, séparés par 100, 600, 700, 800pb et encore 800pb... Mais ça ne te donne pas l'ordre selon lequel ils sont placés les uns par rapport aux autres... Tu n'as donc toujours pas la carte de ton plasmide avec cette simple information.  [...]

[Biologie Moléculaire] Résolution gel d'agarose

alors on pourrait remettre en cause la digestion sauf que je vois bien mes grosses bandes et les petites sont là mais déformées ou à peine visibles.  [...] je l'ai pas dit dans mon message mais je vois très bien mes grosses bandes de digestion et les petites bandes du marqueur de taille. j'ai essayé de mettre plus d'échantillon et le résultat était le meme. là je suis en train d'essayer un nouveau bleu de charge car il pourrait masquer les petites bandes (d'après le labo). je croise les doigts.  [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.  [...] Le probleme c'est que pour le puits 6 je ne sais pas quoi déduire... Pourquoi y a t il 2 bandes La bande a 3000 correspondrait à un excès de plasmides non recombinants et la bande a 6000 mon plasmide contenant l'insert Le soucis c'est que quand j'ai lysé les bactéries, je n'en n'ai vu aucune de bleue dans le culot contrairement à l'échantillon A.  [...]

[Biologie Moléculaire] le clonage impossible, ou comment se prendre la tete...

Comme toi je digère mon plasmide avec 2 enzymes de restriction qui produisent des bouts cohésifs complémentaires (XbaI et NheI), puis je fais migrer sur gel (mais je colore avec du BET) puis je découpe mes bandes, purifie sur colonne en utilisant le même kit de purification que toi, puis je fais une ligation o/n à 16°C.  [...] J'ai également tenté d'insérer ma séquence codante dans un autre plasmide d'expression. là je digère mes deux plasmides (le vecteur vide et mon plasmide parental ) avec EcoRI et XbaI et j'ai testé les rapports 1.3 et 1.9. Lorsque je fais migrer mes produits de ligation, je ne vois plus mon vecteur vide mais des bandes qui pourraient correspondre à mon plasmide avec insert surenroulé et non surenroulé, ainsi que des concaténaires d'insert. Et là encore, je n'ai pas de colonie.  [...]

[Génétique] electrophorese

Du coup quand on fait migrer un plasmide circulaire, on ne doit pas s'étonner de voir plusieurs bandes apparaitre. Je note que les différents superenroulements sont en quantités discretes donc on ne voit pas un smear mais bien plusieurs bandes.  [...] En général, pour résoudre ces problème on linéarise le plasmide ce qui résoud tous les superenroulements et on n'a plus qu'une seule bande de la taille du plasmide. Si il reste des bandes c'est soit que l'enzyme coupe mal soit qu'il y a du simple brin.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

on a digéré un plasmide pBR322 par différentes enzymes et chacune de ces digestions a été soumise à une electrophorèse en gel d'agarose pendant 45 min.  [...] j'ai fais migrer ma prep plasmidique brute (sans digestion préalable)et j'ai 5 bandes, mais la plus haute correspond à une taille de 5kb et la plus basse de 5kb.  [...]