• Santé - Bandes, ARN, Protéine

[Biochimie] L3 Science du vivant: utilisation du dimethylsulfate footprinting

Voila mon problème,je dois étudier une publication pour l'école. Dans cette publi ils étudient un gel de footprintiing sur un arn messager avec ou sans la protéine. Ils utilisent le DMS pour localiser le site de fixation de la protéine. Mais je croyais que dans un footprinting, lorsque l'on observe pas de bandes c'est que l'arn est protégé par la protéine.  [...] Alors que dans la publi ils disent que les bandes observé après traitement au DMS correspondent aux bases protégées par la protéine. Je ne sais pas si j'ai été claire, mais si quelqu'un pouvait m'expliquer l'utilisation du DMS dans le footprinting cela m'aiderai beaucoup.  [...]

[Biochimie] Expression protéique

La protéine est détectée par Western blot et le contrôle positif est correcte. A quel niveau sont sensé agir les régions régulatrices Lors de la traduction N'est ce pas un peu tard une fois que les ARNs sont synthétisés.  [...] L'ARN semble suffisamment exprimé puisqu'il est détecté assez clairement avec 30 cycles d'amplification. Sur WB j'obtiens deux bandes de tailles différentes pour mon contrôle positif mais seulement une bande très très haute dans le gel (très grosse protéine) comparé aux autres dans le reste de mes conditions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

En plus en écrivant cette réponse je me rend compte que quand je passerais au SiRNA, si je vois les autres bandes disparaitre en même temps que celle au bon poids alors j'aurais une partie de ma réponse, à savoir est ce du non-spé ou bien ma protéine.  [...] Toutes les bandes risquent de ne pas suivre le même profil, certaines bandes risquent même d'être stimulées par le siRNA spécifique de ta protéine... En plus de ça, si les autres bandes suivent le même profil d'extinction que la bande à 100 kDa, cela n'apportera aucune preuve d'isoformes.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Cependant, si tu arrives à transférer des bandes plus lourdes que ta protéine, ton problème ne vient probablement pas du transfert à moins que taprotéine ait une composition en acides aminés très atypique (c'est rare pour une protéine géante). Il faudrait donc être certain que la protéine que tu cherches est bien présente et que ton anticorps la reconnait efficacement dans les conditions ou tu l'utilises.  [...] Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle).  [...]

Quel test statistique utiliser?

Je cherche a détecter une différence significative du niveau d'expression d'une protéine entre des cellules transfectées et non transfectées. Pour cela, j'ai réalisé un lysat cellulaire, et fait migrer mes protéines. J'ai par la suite comparé le niveau d'expression de cette protéine en question par mesure de l'intensité des bandes.  [...] Ainsi je possède deux bandes, l'une de la protéine ds cellules transfectées et l'autre de la protéine des cellules non transfectées. Je voudrai maintenant savoir s'il existe unedifférence significative entre ces deux bandes... Est- ce faisable.  [...]

pH d'une solution protéique et Western-blot

J'ai retenté en mettant de la soude 2N (Cf=0,1M) et là j'ai obtenu mes bandes attendues mais il semble que ma protéine se soit dégradée car j'ai aussi des bandes à un poids moléculaire plus faible.  [...] C'est ce qu'il fallait faire. Si vous avez des bandes supplémentaires, c'est soit que votre protéine n'est pas pure, soit qu'elle a été dégradée avant l'analyse sur gel.  [...]

[Biotechnologie] purification d'une protéine

Il semble que l'on a fait une étape ou l'on obtient la protéine un peu plus purifié de l'extrait cellulaire (la comparaison des deux nous donne quelques bandes en moins ) et dans le puit 4 une protéine purifié de façon plus nette (il ne reste que la bande de la protéine).  [...] Tu fais une première purification et tu sors ta protéine plus des protéines aspécifiques. En coupant tu détaches de ta colonne uniquement ta protéine (ou presque), et tu repurifies après. Au final la deuxième purif donne une protéine plus pure que la première (moins de bandes parasites).  [...]

[Biochimie] Electrophorèse en condition dénaturante et native

Alors on réalise une électrophorèse sur la Bêta-Lactoglobuline (une protéine du lactosérum) dans les conditions natives, cette dernière donne une migration en deux bandes A et B d'égales intensités mais ayant des niveaux de migrations différents. Par contre, son électrophorèse en présence de Dodécyl sulfate de sodium (SDS), donne une migration en une bande unique dont le PM est évalué à 18300 Daltons.  [...] Je pense que lors de l'électrophorèse en conditions natives, la protéine est séparée en fonction de sa charge et de son poids moléculaire(PM) d'où la migration en deux bandes A et B. Quant à son électrophorèse en présence de SDS, la séparation de la protéine est en fonction de son PM seulement, je me trompe.  [...]

[Microbiologie] Viabilité d'une bactérie et ARN - Page 2

Pourquoi La mesure de la DO classique, à 260 nm, ne permet pas de faire la discrimination entre ADN et ARN, les deux absorbant à 260 nm. Les protéines absorbent à 280 nm, certains sels ainsi que le phénol absorbent à 230 nm.  [...] je pars d'un échantillon de tissu (des fragments d'intestins d'insecte) minuscule (moins que 100 mg) et pas vraiment propre (débrits cellulaires, sang, protéines,...). à la fin de la manip, j'ai trop peu (ou pas) de produit visible au fond du tube (après la dernière centrifugation du protocole, on a théoriquement un culot d'ARN qu'on redissout dans de l'eau), les concentrations lues par le spectro sont, pour la plupart, faibles et les bandes observées sur les gels de cheking à peine visibles.  [...]

électrophorèse

je suis d'accord avec la dernière réponse. je pense aussi que c'est dû au fait que les ARNm sont purifiés alors que les pistes 5,6,8,9 sont totaux donc peut être liés à des protéines. c'est juste une idée mais ce n'est pas sûr.  [...] Pour ma part je pense que les bandes sont plus larges car elle correspondent aux ARNr qui sont en effet présents à hauteur de 80% dans le cytoplasme, mais qui sont aussi associés à des protéines.  [...]