• Santé - Bande, Quantité, Protéine

[Biologie Moléculaire] Biochimie: méthode de Western Blot

En fait, doser les protéines avant un Western blot permet de déposer la même quantité de protéines dans chaque et pour chaque échantillon.  [...] Cependant, si c'est juste pour s'assurer de la présence (ou l'absence) d'une protéine, il n'y a théoriquement pas besoin de cette étape (même si c'est plus rigoureux de la faire).  [...]

Problème de migration SDS-PAGE

Je dépose donc ma fraction totale (2uL de protéine stock + 18uL de Laemmli Buffer 5X), ma fraction soluble concentré qui est resuspendu dans du Laemmli Buffer 5X, et mon culot.  [...] Je fais migrer mes fractions sur un gel SDS-PAGE 15%, la migration ne migre pas droite par rappport à mon marqueur de taille, j'ai des trop grosse bande (non du à la quantité de protéine déposée) qui déborde c'est assez bizzarre auriez-vous une solution à mon soucis.  [...]

[Biotechnologie] quantification des protéines

ils ont fait une electrophorese en 2D, ensuite ils ont autoradiographié le gel, ensuite ils disent qu'ils ont excisé les spots et qu'ils ont fait une scintillation liquide puis denombrement. d'autre part, ils disent qu'ils ont excisé d'autres spots et qu'ils ont analysé les acides aminés.   [...] L'autoradiographie permet de reveler les spots sur le gel 2D. Ils decoupent les spot et ils font une scintillation liquide pour quantifier (la radiactivite est proportionelle a la quantite de proteine), puis ils envoient la bande en MS ou edman pour avoir la sequence en AA.  [...]

Saturation BSA pour purif de protéine His-tagged

Or il s'avère que lors de nos purifs, nous obtenons certes la protéine P couplée à H (=His) (donc rien d'anormal) mais également une grosse quantité de protéine P seule sans l'autre protéine couplée à l'histidine (la taille de la bande le confirme), ce qui n'est pas normal (bien que l'on surexprime P et H).  [...] Donc je me demande si on ne pourrai pas enlever ce bruit de fond (qui ne doit pas partir totalement car les protéines sont surexprimées mais qui doit quand même fortement diminuer) en saturant la résine avec 1% BSA avant l'incubation avec les échantillons.  [...]

[Biologie Cellulaire] electrophorèse

j'aimerai savoir pourquopi lors d'une électrophorèse i y a certaines bandes qui apparaissent plus large que d'autres, que signifie l'importance de ces bandes.  [...] Alors il peut y avoir les deux cas de figures. La bande peut être plus large parce qu'il y a beaucoup d'une protéine en particulier (toutes les protéines ne sont pas en quantités équivalentes dans une cellule), ou il peut également y avoir plusieurs protéines de tailles proches qui vont former une bande large sur le gel.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

Je n'ai pas dit que l'argent etait quantitatif, mais etait plus sensible que le bleu de coomassie. Finallement c'est ce qui nous interesse quand on cherche a vérifier la puretée d'une protéine.  [...] Et les gens qui font de la protéomique te diront qu'il est beaucoup plus souhaitable d'utiliser le bleu coloïdal que l'argent. la sensibilité me parait moins importante que la quantification de la bande lorsque tu veux t'assurer d'avoir assez de protéine pour faire quelque chose avec.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Mais pour mes protéines, je n ai aucune bande supérieure à 200kda. Evidement après incubation avec mon AC, je n ai pu rien révéler. Cependant, la b actine est tres bien révélée (beaucoup même, car j ai dû loader une quantité très élevée de protéines). Donc, je pense que.  [...] Le dot blot marche donc c'est plutôt bon signe, même si ça n'exclue pas tous les artefacts possibles liés à ton anticorps. S'agit-il d'un anticorps polyclonal ou monoclonal directement dirigé contre ta protéine ou d'un anticorps dirigé contre une étiquette que tu as ajouté Quand tu utilises cet anticorps, tu ne vois pas ta protéine mais vois-tu d'autres bandes plus petites ailleurs sur le gel Si tu vois des bandes plus petites, s'agit-il d'une bande unique (dans ce cas, il s'agit probablement d'une reconnaissance non spécifique d'une protéine qui n'a rien à voir) ou de plusieurs bandes et en particulier de bandes proches les unes des autres (dans ce cas c'est sans doute une dégradation partielle).  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

La différence d'exposition permet de voir si de nouvelles bandes apparaissent. Par exemple, tu peux voir sur le temps d'exposition long des bandes qui sont invisibles sur le temps d'exposition court (car la quantité de protéines correspondant a cette bande est faible, voir figure 4 gel E).  [...] L'actine est, bien entendu, une protéine ubiquitaire dont on estime que les différents traitements appliqués aux cellules ne vont pas modifier la concentration. Ainsi, on s'en sert pour certifier que l'on a bien déposer la même quantité globale de protéine dans les deux puits (contrôle et expérimental).  [...]

[Biologie Moléculaire] Méthodes d'étude de l'ADN

On voit sur le contrôle (des cellules Hela du laboratoire) une bande majoritaire détectée, qui a une taille d'environ 35kDa (le marqueur de taille n'est pas dans l'image ici), et qui correspond vraisemblablement à notre protéine. Mais on observe également une petite bande au dessous, et plusieurs bande au dessus (60-70kDa).  [...] Finalement, ces cellules doivent exprimé la protéine SC35 et la protéine SC35GFP (fluorescente, au cas où ). La GFP faisant 27kDa, la protéine SC35GFP doit donc faire environ 27+35=62kDa. Et l'on observe réellement une bande supplémentaire forte (car expression intense) et du même niveau environ que la protéine native, que l'on observe également à 35kDa.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Dans un deuxième temps j'ai produit un anticorps reconnaissant cette protéine et j'ai fait un western avec l'anticorps purifié. J'observe alors une bande au bon poids et d'autres plus petites (ne fait pas une smire, il n'y a que 3 bandes de plus).  [...] En plus en écrivant cette réponse je me rend compte que quand je passerais au SiRNA, si je vois les autres bandes disparaitre en même temps que celle au bon poids alors j'aurais une partie de ma réponse, à savoir est ce du non-spé ou bien ma protéine.  [...]