• Santé - Bactéries, Transformation, Boîte

[Biologie Cellulaire] Stockage des bactéries thermocompétentes?

Après transformation de ces bactéries (avec mon vecteur et le vecteur de contrôle), je n'ai obtenu aucune colonie sur boite de pétri.  [...] C'est possible, la stabilité d'un plasmide est souvent lié à son utilisation par la bactérie, si celui ci n'apporte aucun avantage sélectif, celui ci sera délété (avantage sélectif, pas besoin de le dupliquer, de le transcrire/ traduire, etc.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

Ensuite il faut insérer tout les plasmides dans une bactérie lambda, effectuer une transformation bactérienne pour rendre la protéine native inefficace. Puis la bactérie portant le bon plasmide est sélectionnée parmi toutes les autres sur un milieu nécessitant la protéine d'intérêt (or le gène natif ayant été muté, la protéine ne pourra provenir que du plasmide).  [...] Ainsi, en ajoutant de l'ampicilline au milieu, seules celles avec un vecteur survivent. Vous sélectionnez les bactéries transformées, pas nécessairement celles qui contiennent votre fragment d'ADN d'intérêt.  [...]

[Biologie Cellulaire] Les colonies de bactéries

C'est cette propriété qui est utilisée en microbiologie pour sélectionner des bactérie résistantes à un antibiotique (après transformation par ex). Sur le grand nombre de bactérie qui sera utilisé et ensemencé sur boite de pétri, on veut pouvoir sélectionner les bactéries qui exprimeront le gène de résistance.  [...] Comme il peut y avoir une grande hétérogénéité entre bactéries on va alors sélectionner des clones (identifiable par la formation de colonies isolées), chaque clone dérivant donc d'une seule bactérie, et par définition étant donc identique à cette cellule d'origine.  [...]

[Biochimie] Problème de transformation

Enfin, quel est le volume de culture dans lequel tu as fait pousser tes bactéries après la transformation est-ce qu'il y avait déjà de la kanamycine dedans et quel volume as-tu utilisé pour étaler sur ta boite.  [...] Je ne pense franchement pas que ca ait la moindre influence. le choc thermique est important. si tu diminues la vitesse, tes bactéries n'auront même pas le temps d'être transformées.. et 42°C, pour E. coli, ca n'est pas optimal, mais c'est pas non plus comme si tu les laissais une heure à 60°C, ca ne va certainement pas les tuer.  [...]

PCR sur colonie après insertion chromosomique... ?

Tu n'es jamais sur de ce qu'il y a dans tes boites, il y a de nombreuses bactéries possédant des résistances antibiotiques, pour peu que tu ais manipulé du mieux possible mais qu'une bactérie qui ne vienne pas de ton étalement se soit retrouvé dans ta boite de pétri, tu as peut être une bactérie résistate a la kanamycine et qui ne vienne pas de ce que tu as transformé, qui se soit retrouvé en culture.  [...] deuxièmement, les mutations spontanées ça arrive, alors même si tu était en milieu stéril ++ et qu'aucunes bactéries externes ne s'est retrouvée dans ta boite, il y a tout de même un risque (très faibles, certes) que une de tes bactérie electroporée mais pour laquelle la transformation aurait pas réussi (donc qui ne contiendrai pas ton gène) se retrouve spontanément résistantes à la kanamycine (sans lien avec les résistances que tu insère avec ton ADN linéaire).  [...]

Les colonies satellites dans un milieu aditionné d'Ampicilline

alors tu commence par étaler ton milieu, après la transformation, sur un milieu LB,(tu nommeras cette boite Boite 0) bien sur après avoir fais les dilutions nécessaires pour ne pas avoir un tapis bactérien. tu laisse pousser le temps nécessaire et tu prépare 3 autres boites 1. LB+Amp. 2. LB+Antibio 2. 3. LB+Antibio 3.  [...] Dans un transformation classique (que ce soit avec des cellules électrocompétentes ou avec des chemocompétentes), tu dois laisser 1h tes bactéries dans du LB liquide (le temps que les bactéries qui possèdent le plasmide puissent exprimer la protéine donnant la résistance).  [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

Ou plutôt les bactéries étaient compétentes (électro- ou thermocompétentes) et vous avez fait une transformation avec vos plasmides recombinants au sein desquels vous aviez auparavant cloné un insert.  [...] Questions. jJe crois que je faisais une erreur en associant la transformation des bactéries et leur compétences. Quest ce qu'une cellule compétente C'est une cellule transformée.  [...]

[Biochimie] La fermentation Lactique.

Cependant pourquoi les industriels utilisent ces bactéries au lieu d'autres bactéries.Autres bactéries qui permettrait la transformation du galactose également et donc une acidification plus rapide du mélange et donc une action plus rapide sur la caséine et ainsi une coagulation plus rapide.  [...] Et puis la transformation de l'acide pyruvique en lactique se fait il uniquement en voie anaérobie dans ces bactéries Et si oui comment font les industriels pour respecter cette condition.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...] @flyingbike. mon expérience perso c'est que la ligation proprement dite est rarement le problème. Quasiment tous les problèmes de ligation que j'ai vu sont en fait des problèmes de restriction ou de transformation (bactéries pas suffisamment compétentes).  [...]

[Biochimie] Echec de la Transformation Ecoli

J'ai fait 6 transformations sur les Ecoli électrocompétentes hier. Pr controler, j'ai fait un miniprep,puis déposer l'ADN plasmidique sur gel d'agorose, j'ai trouvé la bonne taille de plasmide, la méthode que j'ai utilisée pr la transformation est L'electroporation, la machine est BioRAD Pulse Controller Gene Pulser.  [...] En effet, après la transformation, j'ai laissé les bactéries pousser 1 h à 37, puis je les ai étalées dans des boites pétri + Ampicilline ce qui m'a permis la sélection, puis incubation à 37 une nuit, mais aujourd'hui, j'ai aucune colonie.  [...]