• Santé - ARN, Synthèse, échantillon

[Biotechnologie] Comment déterminer le rendement d'une RT?

La seule methode pour determiner un rendement de RT est de rajouter un ARN de synthese pur et de quantitee connue. Si tu sais combien tu met de cet ARN au depart, tu va le traiter comme les autres lors de la RT et lors de ta PCR tu va quantifier ton ADNc provenant de cet ARN en meme temps que tes echantillons.  [...] mais j'ai deux remarques. si tu met un ARN de synthése l'efficacité de la transcription sur celui ci peut dans certain cas ne pas refléter l'eficacité de la RT sur l'ensemble de la population des ARN de l'echantillon.  [...]

Définition | RT-PCR | Futura Santé

La RT-PCR est une technique qui permet de faire une PCR ( réaction en chaîne par polymérase ) à partir d'un échantillon d' ARN. L' ARN est tout d'abord rétrotranscrit grâce à une enzyme appelée transcriptase inverse, qui permet la synthèse de l' ADN complémentaire ( ADNc ).  [...] La RT-PCR peut se faire dans un appareil particulier qui permet de visionner en temps réel la synthèse des fragments d' ADN. Pour cela, des molécules fluorescentes qui se fixent sur l'ADN sont utilisées. La fluorescence de l'échantillon augmente proportionnellement au nombre de molécules d'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Si tu as utilisé la même quantité d'ARN pour les 2 RT, alors c'est que tu as bien un différence. Par contre si tu avais pris x ul de chaque échantillon pour faire la RT, alors la il faudrait normaliser par la quantité d'ARN utilisé.  [...] En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers.  [...]

Extraction ARN/lipides à partir d'un même échantillon

Extraction ARN/lipides à partir d'un même échantillon.  [...] Bonjour, je souhaiterai savoir si quelqu'un connait un protocole permettant d'extraire à partir d'un unique échantillon ARN et lipides en même temps, l'échantillon étant de très faible quantité.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème PCR : Besoin d'aide

quand j'utilise l'ARN synthétique que l'on ma fourni comme Témoin Positif, j'ai une bande, mais quand j'utilise mes échantillons de terrains, je n'ia pas de bande... mais je ne l'ai encore fait que sur un seul échantillon... je vais réessayer. merci beaucoup en tout cas.  [...] 1) Je fais une extraction d'ARN (trizol chloroform) sur échantillon de sang (bovin ou ovin). J'extrais donc l'ARN de l'hôte + l'ARN viral (s'il est présent).  [...]

[Biologie Moléculaire] quantification de la charge virale

Je veux calculer le nombre de copies du génome viral (virus à ARN ) contenu dans mon échantillon d'ARN (50ng/µl).  [...] Je sais que je dois faire une courbe standard afin de pouvoir quantifier.   [...]

[Biologie Moléculaire] contrôle interne en RTqPCR

Pour ces raisons (et quelques autres), on utilise un témoin interne, c'est à dire on amplifie un ARN qui se trouve normalement à concentration constante dans notre échantillon (du moins tout le temps exprimé à un niveau détectable). Ca en fait ainsi un témoin positif à l'intérieur même du puits.  [...] Si il y a amplification du témoin interne, on a bien extrait de l'ARN non lysée de notre échantilon et la PCR n'est pas inhibée, donc un résultat négatif indique bien que l'échantillon ne contient pas ton ARN cible (donc qu'il est bien négatif).  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

Tu peux par exemple en utilisant un nanodrop connaitre la quantité d'ARN que tu as dans ton échantillon. Si tu t'intéresses à un ARN en particulier par exemple la transcription du facteur de croissance TGFB par rapport à différent stimuli tu auras une quantité de cet ARN qui sera différentes en fonction de ton échantillon 1 et 2.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]

[Biologie Moléculaire] Composition RNA later

En plongeant un échantillon de tissu dedans, ses ARN évitent la dégradation.  [...] J'ai appris que le RNA later était constitué de EDTA,citrate de sodium,sulfate d'ammonium et d'eau RNase free.Seuleument, en tentant de reproduire du RNA later,après autoclavage le sulfate d'ammonium précipite.Savez vous pourquoi.   [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent: préparer gamme pr qRT-PCR

Je veux faire une qRT-PCR, pour tester mes primers que j'utilise pour la 1ère fois, on m'a dit qu'il faut que je réalise une gamme de mes cDNA. Ma collègue partait d'un échantillon à 2,1 µg d'ARN total, après la RT elle commence par diluer les cDNA au 1/4 puis au 1/10, 1/50, 1/100, 1/150.  [...] Mon échantillon est moins concentré en ARN ~0,6 µg (échantillons rares), donc je me dis que je devrais le diluer au 1/2 puis faire ma gamme, est-ce suffisant j'ai besoin de vos conseils car comme je l'ai dit les échantillons sont rares et je voudrais pas rater cette manip,  [...]