• Santé - ARN, Extraits, Contrôles, ADN

[Biologie Moléculaire] qPCR sur espèces proches mais différentes

Idealement tu utilises les memes amplicons. en traitant les ARN extraits a la DNase avant la RT et en faisant un controles RT- tu t'assures de ne pas amplifier de contaminants ADN a la place de tes ARN.  [...] trouve un gène rapporteur (pas le 16s) dont l'expression est stable chez toutes tes espèces dans tes conditions d'études (moi j'en ai 6). De cette facon tu pourra comparer les deux espèces en simultanée. Evidement si le Ct est différent entre chaque espèce, effectivement tu ferai mieu de traité tes données séparement.   [...]

ARN en PCR

Afin d'effectuer une PCR sur un extraits d'ARN (et observer une amplification) il faut d'abord effectuer une Reverse-Transcription qui permet d'obtenir de l'ADNc (ADN complémentaire) à partir du brin d'ARN.  [...] Le fait qu'elle ne reconnaisse pas l'ARN n'a rien à voir avec la structure double brin mais avec l'absence du 2'-OH de l'ADN. La présence du 2'-OH dans l'ARN conduit à des contraintes stériques et électrostatiques incompatibles avec l'interaction avec la Taq Polymerase.  [...]

qPCR résultats hors gamme standard!!!

Pour les macrophages je peux savoir à peu près le nb de cellules que j'extrais mais c'est beaucoup plus dur pour le sang (globules rouges plus globules blancs). je traite mes extraits d'ARN avec de la DNAse alors j'espère qu'il n'y a pas d'ADN génomique dans mes échantillons.  [...] 3) Je réitère ma proposition d'estimer la quantité d'ADN génomique contaminant par un couple d'amorce situé dans un intron. C'est un contrôle de contamination et de niveau de bruit de fond imparable.  [...]

Insertion du Bromure d'Ethidium

mais ce que vous n'avez pas compris dans ma question est. comment l'agent peut s'insérer dans un ADN déjà formé (ceci c'est vrai que y a un truc qui m'a échappé). j'explique. je veux faire une PCR classique. a partir de mes extraits d'ARN je fais une synthèse d'ADNc, jusque la c'est clair.  [...] alors ces ADNc je vais les faire migrer sur un gel d'agarose (qui contient ce fameux BEt), ces ADN étant déjà formés (il n y a plus l'étape d'appariement de bases pour que le BEt s'insère ) alors je reviens a ma question, dans ce cas la comment le BEt peut s'inserer.  [...]

[Génétique] PCR ou RT-PCR

La RT n'est pas forcément spécifique. par exemple, tu veux quantifier un ARN particulier dans un tissu. Pour ça, tu fais une RT avec les ARN extraits de ce tissu avec des amorces aléatoires, tu obtiens donc des ADNc correspondant à tous tes ARN. Ensuite tu peux amplifier par PCR une région spécifique en utilisant des amorces spécifiques.  [...] Vous n'avez jamais remarqué une dégradation plus rapide des ARNm A ma connaissance, à part chez les moisissures où l'ARN 16S apparait fréquemment sur les électrophorèses d'ADN, c'est TOUJOURS plus compliquée à extraire et conserver intact.  [...]

[Biologie Moléculaire] Révélation des extraits d'ADN

je crois que je me suis trop précipitée avant de me poser des questions, les bandes bleues ont finalement révélées une fluorescence bien nette pour les premiers puits qui correspondaient à des ADN extraits avec un kit tout prêt.  [...] par contre la seconde série de puits correspondait à des ADN extraits à l'ancienne avec toute l'armada de solutions que j'avais eu tant de mal à préparer.  [...]

Gène de contrôle de dépôt

je compte faire de la PCR semi-quantitative sur des ARN extraits de ganglions rachidiens. J'ai les amorces pour mon gène d'intérêt mais il me manque un couple d'amorces pour amplifier un gène de contrôle.  [...] j'aurais tendance a penser que de maniere generale l'actine ou la tubuline sont de bons controles puisque ces proteines sont constitutivement fortement exprimées.  [...]

[Biochimie] Conservation ADN

Ma question concerne la conservation d'extraits d'ADN suspendus dans du TE, est il possible de les conserver à 4°C (frigo) durant une période de 3 mois environs pour une utilisation ultérieure. si ce n'est pas le cas, comment procéder.  [...] Que les choses soient quand même bien claires. Quand je parle de conserver à 4°C des extraits d'ADN, c'est pour faire des PCR simples type génotypage (c'est à dire en général moins de 500 pb). Pour toute autre application, j'emets quand même des réserves. Les extraits dont je parle sont des extraits propres.  [...]

[Biologie Moléculaire] problèmes de PCR , à l' aide!!!

avez-vous entendu parler de kit de purification des extraits d'ADN, pour enlever d'éventuels inhibiteurs de PCR et d'augmenter la concentration j'y pense beaucoup mais j'ai besoin de l'avis de gens comme vous qui connaissent le problème.  [...] l' amorce que j'utilise est une portion de gène Cytochrome oxydase de 710pb standard pour tous les invertébrés. je m'en sers pour vérifier la présence d'adn dans mes extraits. j'ai faits beaucoup d'essais avant de me lancer dans une série de 900 extractions avec cette méthode.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rt-pcr

Je fais de la RT-PCR sur des d'ARN extraits à partir de poumons. Je réalise une extraction au trizol puis sur colonne d'affinité pour purifier mes ARN. Pas de contaminations protéiques, et des ARN de qualité. je réalise ensuite une DNAse avant RT-PCR sur 250ng d'ARN.  [...] D'accord, je suis en train d'en relancer une d'autre échantillons, pour voir si ce problème ne vient pas de mon extraction, la RT est en train de tourner, je vais faire plusieurs contrôle négatif sur la PCR. pour verifier la qualité de mes ARN je fais simplement un gel d'agarose pour voir l'état des ARN ribosomaux.  [...]