• Santé - ARN, Extraits, Cellules, Protéine

[Biologie Moléculaire] Sélection ARNm spécifique puis RT-PCR

Je dispose au départ des ARN totaux extraits de cellules exprimant la protéine étudiée.  [...] oui c'est exactement ça... D'abord la RT qui transforme TOUT tes ARN en ADNc. Puis une PCR (ou qPCR) avec les amorces spécifique à ton gène d'interet...Faut juste être sûr de ces amorces, et pour ça faut séquencer puis blaster...le mieux est de le faire sur ADNg et ADNc (et tu compares.  [...]

DNAchip

2) Fabrication de la sonde à partir des ARN extraits de 2 cultures cellulaires de souris (deux souches de cellules différenciées et différentes ^^), dont on veut comparer l'expression des gènes.  [...] Par contre dans la technique que décrit Eska, j'ai l'impression qu'on ne veut comparer l'expression que pour une seule protéine (puisqu'apparemment on ne fixe qu'une seule sonde Oo) or je me demandais si j'avais rien compris au schmilblick ou si il y a avait pas une technique plus simple que le DNAchip à réaliser (dans le cas d'Eska).  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Tu dis que la protéine que tu veux voir forme des aggrégats mais cela dans des extraits cellulaires. A moins que des aggrégats ne se forment que dans des extraits de cellules surexprimant ta protéine et pas dans des extraits ne la surexprimant pas, tu ne peux pas dire que ces aggrégats sont ta protéine.  [...] En effet, la chaleur induit fréquemment la formation d'aggrégats pour les protéines surexprimées. Je pensais que ces aggrégats étaient visibles dans ton extrait cellulaire mais d'après ce que tu me dis tu les retrouves plutôt sur ton western donc ce n'est pas l'ADN.  [...]

L'espoir d'un vaccin anti-Sida est relancé

Les particules du VIH sont contenues dans une enveloppe où sont ancrées certaines protéines virales, les fameux pics à la surface du virus. La glycoprotéine gp120 est l'une d'elles et sert à la fixation du virus sur le récepteur des cellules humaines, nommé CD4.  [...] Deux équipes de recherche de l' Institut national américain des allergies et des maladies infectieuses (NIAID) ont construit une version modifiée de la protéine gp120 comportant des traits communs à toutes les souches. Ils ont ensuite fait réagir cette protéine avec des lymphocytes B (cellules immunitaires sécrétrices d'anticorps) extraits du sang d'un patient porteur du VIH.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...), la protéine recombinante.  [...] Alors effectivement sur mon western j'ai fait migrer un extrait membranaire de rein et en parallèle un extrait membranaire d'une lignée cellulaire exprimant de façon endogène ma protéine. Les bandes surnuméraires que j'observe dans la lignée sont également présentes dans le rein. C'est effectivement peut être du non spé.  [...]

qPCR résultats hors gamme standard!!!

De plus, 1 µL d'échantillon (ARN ou ADNc ) représente le contenu de combien de cellules Ton résultat peut indiquer que 1 cellule sur 10, sur 100 ou sur 1000 exprime le gène dans ton tissu (tu travailles avec des RT ).  [...] Pour les macrophages je peux savoir à peu près le nb de cellules que j'extrais mais c'est beaucoup plus dur pour le sang (globules rouges plus globules blancs). je traite mes extraits d'ARN avec de la DNAse alors j'espère qu'il n'y a pas d'ADN génomique dans mes échantillons.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR sur espèces proches mais différentes

tu pourrais relativiser tes qPCR en utilisant l'ADN des mouches dont tu as extraits les RNA. Tu amplifies l'ADN du gène que tu cherches (2 copies par cellules) et tu exprimes la quantité d'ARN en % d'ADN.  [...] Idealement tu utilises les memes amplicons. en traitant les ARN extraits a la DNase avant la RT et en faisant un controles RT- tu t'assures de ne pas amplifier de contaminants ADN a la place de tes ARN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

j'essaye de produire une protéine en fusion avec la GST afin de faire des tests d'interaction pull-down avec des extraits cellulaires.  [...] Je souhaite donc fixer ma protéine en fusion en GST sur une colonne pui ensuite faire passer mes différents extraits cellulaires afin de déterminer des éventuels partenaires de ma protéine.  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

Exemple d'applications ben comme dans le sujet que j'ai mis en lien ^^ (pour détecter des protéines ubiquitines, c'est à dire des protéines qui marquent les protéines à éliminer, éliminés par les protéasomes situés dans les noyaux et cytosoles des cellules d'ailleurs).  [...] Alors, pourquoi ne pas utiliser un Ig@ubiquitine Simplement, parce que vous verriez les bandes shiftées de PCNA mais vous ne sauriez pas dire de quelle protéine il s'agit. Or ce que vous voulez affirmer c'est qu'il s'agit de PCNA ubiquitinylé. Maintenant, la question que je me pose (mais vous devez avoir la réponse dans un coin ou même peut être dans la légende que je n'ai pas lu) c'est pourquoi il y a autant de PCNA dans leurs extraits et à priori dans leurs cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rt-pcr

Je fais de la RT-PCR sur des d'ARN extraits à partir de poumons. Je réalise une extraction au trizol puis sur colonne d'affinité pour purifier mes ARN. Pas de contaminations protéiques, et des ARN de qualité. je réalise ensuite une DNAse avant RT-PCR sur 250ng d'ARN.  [...] Bon, même en présence d'RNAse out, toujours le même profil... je n'ai plus d'idées quant à l'origine de ce problème. quand je test sur des échantillons déjà extrait et purifié, je n'est pas d'amplification du 28S, mais j'ai plus c'est patates.. quelqu'un a une autre idée... svp je suis à bout de nerf.  [...]