• Santé - Analyse, Western, Protéines

[Biologie Cellulaire] Centrifugation: surnageant/culot

Pourriez-vous m'expliquer, suite à une centrifugation puis une analyse Western Blot après electrophorèse ce que signifie le fait que des protéines soient dans le culot ou dans le surnageant.  [...] On sépare les protéines soluble du matériel insoluble, les organites cellulaires comme les noyaux s'accumulent dans le fond du tube tandis que les protéines solubles se retrouvent dans le surnageant.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Je cherche le moyen d'optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire. Je travaille sur FAS (274kDa) et je n'arrive pas à la transférer.  [...] Certaines protéines notamment les plus grosses et les membranaires restaient alors piégées, elles restaient donc tout en haut du gel (dans le gel de concentration) et le WB était donc systématiquement négatif. Si tu es dans cette situation,tes échantillons doivent être fortement turbides et par ailleurs ils doivent extrêmement visqueux voire carrément pateux et le chargement doit être particulièrement difficile.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation de figures : Protéine p53

On en conclut que cette expérience de GST démontre que p53 interagit avec la protéine Chk2 en condition de stress. En revanche, p53 n'interagit pas avec le GST seul.  [...] Pour cela, on a utilisé des cellules d'ostéosarcome que l'on a irradié dans le temps, et on a analysé l'expression de p53 et la phosphorylation sur la sérine 20.  [...]

influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

Les domaines transmembranaires sont de tres forts inhibiteurs de la secretion, car la protein va se loger dans la membrane et ne peut plu setre sécrétée, je pense que ton probleme pourrait se trouver a ce niveau la. En tout cas a chaque fois que j'ai vu un protocole pour purifier des proteines sécrétées il etait précisé qu'il ne fallait pas de domaines transmembranaires.  [...] Oui, j'ai fait une analyse par Western Blot (2 anticorps, révélation électroluminescente). Je ne retrouve rien dans le surnageant, mais je retrouve la protéine dans la fraction soluble et non soluble après la lyse des cellules.  [...]

[Biotechnologie] marquage radioactif

Juste un détail, les immunoglobulines possèdent suffisamment d'a.a. pour être qualifiées plutôt de protéines que de peptides.  [...] Dans le cas d'un test d'internalisation de protéine radio-marquées, peut-on ensuite utiliser un western Blot, un test ELISA ou une analyse par spectrométrie de masse pour mesurer et quantifier cette internalisation Quelle est la méthode la plus appropriée.  [...]

[Biologie Cellulaire] centrifugation différentielle, peroxisomes

Parce que j'ai fait un Tp où on doit repérer une proteine par immunofluorescence, sur les photos tirées du microscope à fluorescence non confocal, la proteine serait plutôt dans le cytoplasme, peut-être sous forme de vésicules parce que c'est pas très homogène.  [...] On casse les cellules et on fait des centrifugation différentielles, celle à 2000G sépare le culot C1 du surnageant S1. Par analyse avec le Western Blot, avec les Anti-corps dirigés contre ma proteine, on voit que la proteine recherchée est dans la fraction C1.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

J'utilise la technique du western blot afin de quantifier mes protéines d'intérêt (par chemiluminescence, révélation par l'ECL+ et analyseur d'image permettant de quantifier mes blots), mais une question se pose à moi. pourquoi dit-on du western blot que c'est une technique semi-quantitative Quelles sont les limites de la quantification.  [...] la phosphorylation d'une protéine augmentée de l'ordre de 50% chez les animaux soumis à un protocole particulier par rapport aux témoins), c'est une méthode satisfaisante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Déterminer le gène codant pour une protéine

J'ai pris l'habitude pour chaque cours, quand c'est possible, de me demander ce que je ferai si j'étais en labo de recherche et que je devais étudier le mécanisme présenté dans le cours. Ce matin j'étudiais les transporteurs protéiques de la membrane plasmique, je me demandais si il y a des méthodes d'études spécifiques, j'ai fais quelques recherches mais je n'ai rien trouvé de satisfaisant.  [...] Alors je me suis dis que j'analyserai le transporteur comme n'importe quel protéines (western blot etc). Mais je me demandais comment déterminer la séquence d'acides nucléique codant pour une protéine je me doute qu'il faut déterminer l'enchainement d'AA avec la méthode de sanger par exemple, mais je ne saurai quoi faire après.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

Puis pour verifier la purete je ferais sur un gel d un cote une coloration au bleu de coomassie qui va colorer toute tes proteines et de l'autre un western blot avec des anticorps diriges contre la proteine que tu veux.. puis tu compare les 2 gels.  [...] Comparer un gel au bleu de Coomacie avec un western me parait être une bonne idée mais est-on sur que dans l'extrait protéique il n'y aura que la protéine que l'on veut étudier Si on utilise un anticorps contre notre protéine d'intérêt on ne verra qu'elle mais cela ne veux pas dire qu'il n'y a pas d'autres protéines que l'on ne voit pas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Régulation de NFAT5

Donc l'idée est de faire une immunoprécipitation des protéines ubiquitinilées. Puis un western anti ubiquitine permet de voir l'ensemble des protéines précipitées. Ensuite, sur le même extrait on fait un western anti NFAT5 afin de savoir si il fait partie des protéines précipitées.  [...] La panneau input correspond à l'extrait protéique qui ne c'est pas fixé sur les billes (non immunoprécipité). C'est un contrôle qui permet de s'assurer que les protéines sont quand même présentes dans l'extrait au départ. Si on ne le fait pas on est jamais certain que NFAT5 est présent dans l'extrait initial et du coup un résultat négatif pourrait simplement correspondre à une absence de protéine.  [...]