• Santé - Amplification, Clonage, Vecteur

PCR et vecteur de clonage

PCR et vecteur de clonage sont deux technique qui permettent d'amplifier un gène d'intérêt et je sais que l'amplification par PCR est de l'ordre d'un million de copies en quelques heures mais quel est l'ordre de grandeur pour le vecteur de clonage (inséré dans une bactérie E.coli BL21).  [...] En ce qui concerne le clonage, est-ce que l'on peut vraiment déterminer l'ordre d'amplification puisque l'insert n'est pas forcément incorporé dans le bon sens et qu'il risque également d'y avoir des réactions intramoléculaires des extrémités du vecteur de clonage.  [...]

[Biologie Moléculaire] Etapes de la PCR

C'est dans le cadre d'un TP on a réalisé l'amplification d'un cDNA d'un gène par PCR pour pouvoir ensuite réaliser un clonage à l'aide du vecteur TOPO.  [...] Déjà les trois cycles de 5 minutes à 72°C je trouve ça bizarre (après les cycles de dénaturation, hybridation et élongation si j'ai bien compris )... Normalement on fait une seule étape de 10 ou 15 minutes à la fin (donc 1 seul cycle ).   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

Pour le sous-clonage, c'est juste que j'ai envie de gagner du temps. Si je peux directement passer mon produit d'amplification dans mon vecteur d'expression, ça me fait gagner 2/3 jours ^^. Donc je cherche à savoir si c'est possible et si oui comment (précaution à prendre, etc.  [...] ..). Car le sous-clonage (vecteur de propagation ) permet d'avoir une grosse quantité de son insert, propre, et avec les extrémités adéquates pour ensuite refaire un clonage mais dans le vecteur d'expression de la future protéine recombinante.  [...]

apoptose

en plus, le clonage peut servir aux transformations aussi, quand on transforme les bactéries avec le plasmide portant l'ADN amplifié.  [...] je ne peux pas contacter mes prof car nous sommes en vacances, mais je vais vous répendre d'apres mes connaissances, le clonage necessite un vecteur donc culture et prend du temps, la PCR est plus rapide (se réalise dans un tube à essai) et le taux d'amplification est très élevé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment ajouter un petide signal à une proteine?

Mais deux seulement suffisent. La premiere, qui amplifie le peptide signal, avec sur une des amorces un site de restriction (cohesif), que tu rajouteras egalement sur le sequence de la CFP de la meme maniere (sauf bien sur si c'est une CFP commercial, avec deja un bon choix d'enzyme qui coupe ou il faut).   [...] Tu peux ensuite purifier tes fragments, les digerer, les repurifier puis faire le clonage (transformation, amplification, verification) et hop, le tour est joue. Durer moyenne pour un tel clonage. une semaine max, sans compter le temps necessaire pour commander les amorces.  [...]

transgenese

C'est aussi le vecteur qui, par sa propre construction (exemple, présence de promoteurs forts), pourra assurer ou contrôler l'expression des gènes clonés (vecteurs d'expression).  [...] La pratique en soit est assez simple mais fastidieuse. Il faut injecter l'ADN dans le noyau de la cellule à l'aide d'une minuscule pipette. Tout se fait à la moins avec un amplificateur de mouvement et un microscope, et il faut donc être très doué.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

Je dois donc purifier mon plasmide sur gel après digestion (kit M&N et qiagen testé). Quoique je fasse, le clonage est impossible ensuite. J'ai bien sur essayer de le laver (miniElute de qiagen ou précipiation éthanolique). J'ai changé 3 fois de ligases. Alors que mon clonage fonctionne lorsque je ne purifie pas mon vecteur.  [...] L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...]

Structure d'un phage

Mais ou se trouve la fameux site cos qui rend possible l' empaquetage de l'ADN dans la capside et à quoi sert t il dans le clonage.  [...] Le phage possède bien un ADN double brin linéaire et ses extrémités sont les séquences COS (séquences cohésives d'ADN simple brin qui font 12 bases). L'ADN du phage peut donc se circulariser grâce aux COS. On peut empaqueter in vitro de l'ADN exogène dans l'ADN phagique tout en conservant les régions COS, le phage encapside par reconnaissance des régions COS puis après infection sur des bactéries l'ADN se re-circularise dans son cytoplasme.   [...]

Projet clonage et expression d'un gène

Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...] Une fois que le résultat de l'amplification a été vérifier (et digérer) sur gel, il en possible de cloner le fragment d'intérêt dans le vecteur voulu (ici pET-15b).  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

On me demande de présenter les caractéristique generales de ce type de vecteur pour permettre son amplification dans le colibacille puis l'expression de notre proteine recombinante dans les cellules de souris.  [...] je n'y ai jamais réfléchi mais en effet les vecteurs de clonage contiennent la plupart du temps une séquence signal de polyadénylation.  [...]