• Santé - Amplification, Amorces, Sites

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

J'essaye de faire un TA cloning d'un insert (1500pb) dans un vecteur pcDNA3.1 je fais des PCR sur colonies à l'aide des amorces qui m'ont aidé à amplifier le cDNA donc je m'attend à une bande d'environ 1500pb mais à la place de sa j'ai une bandes d'environ 200pb sur presque tout mes clones.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.   [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

La PCR compétitive est basée sur la co-amplification de la matrice d'ADN cible et d'une quantités données d'un ADN standard interne (compétiteur ) portant les mêmes sites de fixation d'amorces.  [...] Alors que les systèmes de PCR en temps réel reposent sur la détection et la quantification d'un émetteur fluorescent pendant le processus d'amplification, et l'augmentation du signal d'émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons produites durant la réaction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Marqueurs RAPD

voici l'objet de mon interrogation. Lorsqu'une seule amorce aléatoire est utilisée, l'amplification a lieu une fois celle ci se fixe sur 2 sites complémentaires peu distants (maximum théorique de la PCR. 3000 pb).  [...] Et voici ma question. Pourquoi une amorce doit elle se fixer sur deux sites peu distants puisque les conditions de synthèse de l'ADN sont réunies lors de la PCR Les conséquences, sont-elles visibles lors de l'hybridation ou lors de la révélation.  [...]

[Microbiologie] Amplification d'un gène par PCR : choix des amorces

Je dois choisir les amorces Forward et Reverse pour amplifier la totalité du gène GAI (1500pdb) dont les codons initiateur et stop sont respectivement, ATG et TAG (soulignés dans la séquence).  [...] Voici la séquence. les deux amorces à utiliser doivent faire 20 nucléotides et le fragment amplifié doit être le plus court possible tout en contenant le codon initiateur et le codon stop.  [...]

Problème de digestion enzymatique

4- Vos recombinants sont issus de purif sur gel d'amplification PCR Beaucoup de possibilités. vous n'avez pas sélectionné la bonne bande sur gel, ou alors vous êtes planté dans les amorces de PCR, expliquant l'absence d'un site normal de restriction.  [...] 7- j'allais oublier la dernière possibilité. Votre plasmide n'est effectivement pas recombinant, essayez de recommencer votre insertion. Si vous le pouvez faites une infusion, ça marche plutôt bien quand on sait s'y prendre.   [...]

Exercice PCR

Bonjour, je dois donner la taille des séquences (pb) qui seront amplifiées par PCR pour chacune des associations possibles des amorces utilisées.  [...] Regardez cette animation. si les deux amorces sont choisies sur le même brin et donc s'hybrident du même coté, il n'y a pas d'ammplification.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de PCR

Bonjour, pour un travail j'ai besoin de savoir 8 raisons qui justifient une très faible quantité de produits PCR après amplification et 3 raisons qui expliqueraient des produits d'amplification multiples ou non spécifiques.  [...] J'ai oublié (mais mes énumérations ne sont pas exhaustives.). si la température d'hybridation des amorces est trop basse ( = stringence diminuée), l'amplification est moins spécifique aussi.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR avec mélange de champignons

Je ne pense pas qu'il s'agisse d'amplification des amorces puisque sinon j'aurai ce pic à la même température à chaque fois alors que quand j'utilise des champigons différents je n'obtiens pas la meme température.  [...] Ou alors, il faudrait que tes deux Tm soit vraiment très proche, donc dans ce cas, le moment (enfin la t°) où la vitesse de relargage du Sybr de l'un diminue serait la même que celle ou ton autre amplicon commencerait à s'ouvrir, et il faudrait que le conjugué des deux soient plus important que la vitesse instantanée de variation de tes deux amplicons à leurs Tm respectifs.   [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription inverse et adn polymerase

Voilà mon problème est l'utlisation de l'adn polymerase 1 pour la synthese du brin complementaire de l'adnc qu'on a obtenu. En effet, cette polymerase est pour moi plutôt faite pour enlever les amorces(chez un procaryote) d'ARN et pour faire de la réparation.  [...] Ceci dit, il est tout à fait possible d'amplifier un produit d'ADNc par PCR directement avec 2 amorces sans passer par l'étape de la synthèse du brin complémentaire. dans un premier temps, une seule amorce pourra s'apparier sur l'ADNc (simple-brin) et l'élongation à partir de cette amorce va générer la synthèse du site pour l'autre amorce, ce qui permet ensuite l'amplification comme à partir d'une matrice db.  [...]

[Biologie Moléculaire] Amplification PCR

En dehors de ça, ce n'est pas la peine de se prendre autant la tête pour un témoin négatif (sauf s'il t'est demandé). Pour être sûr de la validité de ton amplification, tu peux réaliser une PCR emboîtée avec des amorces spécifiques de ton gène. Ainsi si c'est du non spé, tu n'auras aucune amplification sur le produit de la réaction de PCR précédente.  [...] La PCR emboîtée utilise comme matrice le produit d'une première PCR et des amorces hybridant en 3' des amorces utilisées pour la première PCR. Ainsi tu augmente la spécificité de l'amplification puisque tu forces le système d'amplification a être spécifique de ton gène.  [...]