• Santé - Amorces, Sondes, ARN

[Biologie Moléculaire] Hybridation in situ

J'ai fais pendant 3 mois des ISH et je faisais une transcription in vitro, donc mes sondes étaient de l'ARN. Pourquoi as-tu besoin d'amorces.  [...] Les amorces c'est pour designer la sonde que l'on va insérer dans un vecteur qu'il faudra ensuite linéariser par restriction selon l'orientation et transcrire (souvent avec la T3,la T7 ou la SP6 polymérase) pour obtenir de l'ARN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN Lignée cellulaire et Bactérie

même si je ne vois pas bien l'intérêt de mettre des bactéries en culture sur des cellules si tu veux séparer les ARNm distinctement pourquoi ne pas essayer une centrifugation. Ensuite tu extraits une des deux ou les deux phases et tu fais ton extraction.   [...] Ca dépend aussi et surtout de ce que tu veux faire aussi de tes ARN après. RT-PCR en Taqman, si tes amorces et sondes sont bien faites, pas de problème normalement.  [...]

[Biologie Moléculaire] le diagnostic par RT-qPCR multiplexe : problèmes de lecture des fluos!

J'ai d'abord mis au point les simplex de façon indépendante. J'ai ensuite testé le tout en multiplex. Cela fonctionne toujours bien mais il y a quand même un problème. lorsque je mélange les 4 ARNs avec leurs 4 couples amorces/sondes il n'y a pas de soucis.  [...] Par contre, lorsque je mélange les 4 couples amorces/sondes + 1 SEUL ARN et bien la machine sort des CT dans les canaux correspondant aux autres ARNs non présents dans le mélange. Je précise que tout les éventuels problèmes de spécificité avaient été testés au préalable in silico mais aussi en manip.  [...]

[Biologie Moléculaire] Fabricants sondes / amorces PCR

J'aimerais savoir si ces réactifs sont fabriqués par des entreprises spécialisées, où bien si les laboratoires qui utilisent la PCR fabriquent eux-mêmes leurs sondes / amorces.  [...] Pour les thermocyclers, je connais quelques entreprises spécialisées (Roche, QiaGen...). Y a-t-il aussi des fournisseurs spécialisés de sondes / amorces / enzymes Lesquels.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription in vitro de sondes ARN marquées

j'aurai bien besoin de l'avis d'un expert en biologie moléculaire. Je cherche à synthétiser des sondes ARN marquées à la DIG ou à la biotine pour faire de l'hybridation in situ.  [...] Enfin bon, je lance ma transcription et j'ai des super rendements, les DO sont impeccables. Par contre à la migration de ces ARN après purification (lithium/ethanol) je vois des smears, et quelques bandes secondaires apparaitre. Le poids moléculaire de mes transcrits est aussi plus haut qu'attendu (peut-être à cause de la DIG ou de la biotine ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Quand faut-il une amorce?

Les arn, une fois formés, sont pris en charge par un bon nombre de protéines qui vont s'occuper d'euxi(maturation, délocalisation.. différentes selon le type d'ARN).  [...] On peut différencier entre une amorce d'ADN ou d'ARN en utilisant des sondes radioactifs approprier ou avec hybridation moléculaire.Sourthern blot ou Northen blot.  [...]

[Biotechnologie] sonde ARN hybridation

- les sondes ARN anti sens directement radioactives par un phosphate 32 par exemple.  [...] De +, pour marquer in vivo on utilise quelle sonde il doit bien y en avoir une pour pas tuer notre souris.. surement la sonde froide je sais pas, aidez moi svp.  [...]

Contamination qPCR

Je voudrais déjà tester mes produits pour voir d'où ça vient, je voulais faire un test avec la sonde seule d'une part, les amorces seules d'autre part et même l'eau sans rien d'autre dans le puits si jamais c'est un problème de capteur (je m'imagine tout) mais là je ne sais pas si c'est possible de faire ça.  [...] Oui les cônes sont filtrés. Est ce que dans mon puits de plaque je peux introduire uniquement de l'eau sans rien d'autre (ni amorces, ni sondes, ni mix) Je ne vais pas faire que ça comme test mais je préfère tout essayer même si sans amorces ou sondes normalement j'ai pas de signal.  [...]

[Biologie Cellulaire] recherche recette de Loading Buffer et Protocols de RT-PCR semi quantitative

Les possibilités de fluorescence sont le SYBR GREEN ou les sondes FAM-TAMRA. Le sybr green est un intercalent de l'ADN. Les sondes FAM-TAMRA sont des sondes avec un fluorescent et un agent quienscent (de part et d'autres de la sonde). lors de ta PCR les amorces vont amplifier ton fragment et la sonde presente entre des deux amorces va etre degradée ainsi le fluorescent est libéré et quantifié.  [...] deuxieme chose pour le SYBR GREEN. tes amorces doivent bien choisies car tu vas amplifier aussi des zones non interessantes et comme c un intercalant tu quantifieras tout. Mais tu as un moyen de savoir si c'est du spécifique ou non rassures toi.  [...]

[Biologie Moléculaire] qPCR

Classiquement, les concentrations amorces peuvent varier entre 300 et 900nM final. Les concentrations de sondes entre 100 et 400nM final. Les ratios les plus communs sont donc entre 1/5 et 1/2.  [...] De ton coté, je pense qu'il vaut mieux partir avec tes concentrations d'amorces optimisées en Sybr et caler la sonde pour le TaqMan à une concentration moyenne de 200nM final. Ensuite, faire varier la concentration de sondes entre 100 et 400 et regarder si les résultats sont corrects.  [...]