• Santé - Amorces, Sites, Restriction

[Biologie Moléculaire] Clonage

Si tu fais une transformation avec 100ng de plasmide tu peux avoir beaucoup de transformants. Alors si tu peux 1micro gramme de plasmide que tu digères, s'il reste même moins de 10% de plasmide non digéré tu vas avoir des soucis lors de ta transfo.   [...] J'imagine que tu dessines tes amorces en incluant les sites de restriction. Rajoutes-tu des nucléotides supplémentaires sur ces primers (les sites de restriction aiment bien être entourés pour une bonne digestion).  [...]

PCR clonage

Tu as calculé comment ton Tm pour tes amorces avec sites de restriction Tu as peut être tout simplement un problème d'hybridation de tes amorces à cause d'un Tm inapproprié.  [...] mes amorces sont identiques, a part les sites de restcriction, c'est pr ca que les Tm sont élevé, mais est ce que je devais reduire de mes amorces pr que j'aie une Tm convenable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contruction d'un fragment d'ADN à partir de produits PCR

tu veux les mettre dans un ordre précis La meilleure solution je pense est d'utiliser des amorces contenant des sites de restriction et de faire une ligation ensuite.  [...] La methode que tu as decrite est la meilleure pour ce genre de truc. Utiliser des sites de restriction va compliquer la chose. Es tu sur d'avoir bien purifie tes premiers produits PCR histoire de ne pas ramener des amorces dans ton 2eme tours de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR?

Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction.  [...] Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction. alors la c'est definitif je suis dans le champs, je vais attendre que l'image soit validee pour voir si ca m'eclaire.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion.  [...] J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Méga-amorce avantage, inconvéniant

J'ai aucun problème pour ce qui est de dessiner des amorces, de trouver les sites de restriction les plus adéquates mais je ne vois pas ce qu'apporte en plus la méthode et quelles peuvent être les inconvénients (peut être le coût Je sais que commander des amorces à un coût élevé ).  [...] Pour répondre à la limite majeure de cette technique, une 3ème PCR peut être réalisée uniquement avec les amorces de clonage (PCR classique) afin d'amplifier le gène sauvage, et donc obtenir un rendement plus important.  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

J'ai trouvé plusieurs publications à propos, mais la manipulation a l'air compliqué, et j'ai un temps très restreint pour mes manipulations. Je ne veux pas me lancer dans quelque chose de compliqué, mes profs cherchent juste à évaluer mes compétences pratiques en matière de clonage et d'expression.   [...] Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

J'utilise sérial cloner, j'ai identifié les sites de restriction, mais je ne sais pas comment m'y prendre, comment choisir des oligos, introduire des sites de restriction... ETC bref je suis Out -.  [...] 2. Les amorces doivent couvrir combien d acides aminés de l insert Doivent ils contenir uniquement une partie de l insert et un site de restricrestriction.  [...]

[Biochimie] Tag His en N Ter???

Tu veux dire que lors de la PCR au cours de laquelle j'introduis mes sites de restriction spécifiques, je design les amorces de telle sorte qu'elle contienne à la fois le tag his et le site de restriction d'un côté et de l'autre le site de restriction suivi du codon stop.  [...] Tu peux synthetiser des amorces jusqu'a 100 pb. Au dela de 60/70 pb par contre, il faut demander une purif PAGE pour etre sur que tu ais tes amorces de la taille voulue.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR récalcitrante

J'ai testé tes amorces sur un programmes pour vérifier leur design et ils sont vraiment très mauvaise, je pense qu'avant toute chose tu dois vraiment redesigner.  [...] Enfin, pour les amorces par contre je sais qu'elles sont un peu bancal entre elles mais elles sont tout à fait complémentaire de ma matrice (enfin sauf pour les sites de restriction évidemment), j'ai blasté sur ncbi et vérifié avec snapgene viewer.  [...]