• Santé - Amorces, Kit, Plasmide

plasmide pDONR/Zeo

Les flèches avec M13 désignent des régions sur lesquelles s'apparient des amorces qu'ils fournissent peut-être avec le kit et permet de vérifier que le gène est dans le plasmide (PCR, séquence).  [...] ok merci de ta réponse et ROP est ce que tu ne connaitrais pas un site qui parle des plasmides ligation... en général en fait les bases.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Le gene xyz a ete amplifie a partir de l'ADN de la souche abc en utilisant les amorces A (3'sequence5') et B (3'sequence5'). Le produit PCR a ensuite ete purifie par le kit XXX (XXX, France) puis digere par les enzymes bamHI/EcoRI avant d'etre clone dans le plasmide xxx prealablement linearise par les memes enzymes.  [...] J'ai mis mes oligos dans un tableau avec les séquences et commentaires pour dire quel oligo apporte quoi dans l'histoire et j'ai fait un schéma où je les positionne sur les gènes. Le truc est que j'avais séparé mon M&M en 3. Souches bactériennes, plasmides, milieux de culture, Manipulation de l'ADN (tout ce qui est PCR), Construction des plasmides recombinants et je pensais ajouter une 4e partie Séquençage, mais là quand j'y pense, ça me paraît plus logique de le mettre dans Manipulation de l'ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Je suis étudiante en M2 et je suis en train d'essayer de faire une mutagénèse dirigée sur un plasmide de 11kb. Pour cela j'utilise un kit approprié pour ce genre de cas, Quikchange XL Site-directed mutagenesis kit de stratagene.  [...] Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

J'ai déjà failli l'utiliser. Avec quel plasmide travailles-tu Es-tu sûr que l'amorce s'accroche bien dessus Le plasmide est-il bien dénaturé.  [...] je travaille avec un plasmide type pcDNA3 de 4.5 Kb dans lequel g mis l'ADNc du gène du facteur Willebrand (8.9 Kb). l'amorce que j'utilise fait 30 b avec 15 bases de chaque coté de la mutation et elle a été commandée sur le site recommandé par Stratagene, donc je pense pas qu'il y ait un problème à ce niveau.  [...]

Amorces aléatoires PCR RAPD

Pour trouver des amorces spécifiques, je pense donc faire de la RAPD avec des amorces aléatoires mais je ne connai pas bien cette technique, quelqu'un peut il me l'exposer en détail étape par étape.  [...] Existe t'il dans le commerce des Kit amorces spécifiques.  [...]

extraction de gel

je dois faire une extraction d un plasmide qui a migre sur gel d agarose donc je dois faire une extraction sur gel est ce que auelau un peut il m expliquer le concept je dois utiliser le kit de biolabs de monarch.  [...] oui j ai lu le protocole du kit et tout mais se que je veux savoir c est l utilite de re extraire le plasmide sur gel comme on la extre et digere deja.  [...]

Problème lors de ligation

J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).  [...] Je fais rentrer mon plasmide dans mes bactéries compétentes en faisant un heat chok, puis je dépose sur agar avec l'antibiotique de sélection.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

C'est le protocole que j'ai suivit digestion du vecteur, purification du backbone (plasmide sans insert) et de l'insert (kit QIAEXII) j'ai ensuite déphosphorylé le plasmide.  [...] Ok, dans ce cas le plus urgent est de reséquencer le plasmide fourni par les collaborateurs. Il est malheureusement extrêmement courant de ne pas avoir exactement le plasmide que l'on croit parce que t'on collaborateur l'a reçu d'un autre collaborateur qui etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Question purification QIAprep

Il y a aussi la quantité de plasmides qui entre en compte. Je ne sais pas comment tu fais tes preps, nous, nous utilisons le kit Xtra midi. Le principe est une colonne et un filtre (classique pour ce genre de kit). Le truc c'est que si tu charges trop de bactéries tu satures la colonne et ton extraction n'est pas terrible.  [...] En fait le Cm va inhiber la traduction, du coup les cellules vont arreter de pousser, mais la replication de l'ADN va continuer. Ta DO va donc etre stable, mais la quantite d'ADN et donc de plasmide va augmenter. Du coup tu vas recuperer plus de plasmide tout en utilisant un kit pour une miniprep.  [...]

mini prep ou Qiagen

La kit Qiagen ( QiaPrep ) est plus pratique et plus rapide à utiliser. buffer déjà prêt, colonne adaptées pour isoler les plasmides... Mais la technique de miniprep reste la même sauf que le kit facilite son utilisation.  [...] les miniprep classiques servent à screener les clones obtenu aprés transfo. c'est rapide, efficace et bien moins cher qu'un kit utilisant des colonnes pour purifier le plasmide. La qualité de la préparation est largement suffisante pour faire les restrictions necessaires pour vérifier tes transformants.  [...]