• Santé - Aide, échantillons, ARN

[Biologie Moléculaire] j'ai besoin d'aide concernant mes echantillons d'ARN

j'ai eu des echantillons d'ARN tres concentrés apres dosage par spectro,quand j'ai fait le calcule pour faire la reverse transcription,le volume que je dois prelever est tro petit à prelever(=de 0.44µl)alors que ma pipette mesure à partir de 0.5µl,je ne sais pas quoi faire.  [...] tu dilues 2x ton échantillon, et tu prélèves 0.88ul de cette dilution au lieu de 0.44ul de la solution concentrée. Sinon c'est encore plus simple de diluer 10X et de prélever 4.4ul (plus les volumes sont importants, plus les erreurs sont proportionnellement faibles).  [...]

[Biologie Moléculaire] quantitative/real time PCR quelle différence?

Il n'y a pas besoin d'etre quantitatif vu qu'a la base l'urine doit etre sterile. De plus quantifier sous entends normaliser les echantillons, utiliser un gene de menage, une gamme de quantification, des oligos parfaits etc... -. complique et sans interet.  [...] Merci pour toutes vos réponses. Si j'ai bien compris, la PCR en temps réel (après reverse transcription dans ce cas) repose sur la détection de la fluorescence à chaque cycle à l'aide d'un thermocycleur et elle peut être quantitative (normalisation de la quantité d'ARN de départ dans tous les échantillons, choisir un gène de ménage, réalisation de gammes.  [...]

MCF7 cellules cancéreuses, 3 bandes ARN?

non ce que je ne comprend pas c'est la 3 ème bande obsérvé lors de mes dépots d'ARN extrait dans chacun de mes échantillons pour n'importe quel puit.  [...] effectivement mes échantillons d'ARN sont extraits o trizol (phénol-isothiocyanate de guanidine)-chloroforme, précipités à l'isopropanol et lavé à l'éthanol. protocole classique.  [...]

[Biochimie] svp j ai besoin d'aide. mes echantillons ont ete decongeles

[Biochimie] svp j ai besoin d'aide. mes echantillons ont ete decongeles.  [...] Bonjour chères collègues, mon travail de recherche consiste en analyse biochimique de tissus animals ( des poissons) j'ai conservé mes échantillons à -20°C et la catastrophe c'est que cette semaine il y avait une coupure d'électricité dans le centre de recherche et mes échantillons ont été décongelés.  [...]

Gène de ménage (gène de référence...)

- Et ensuite... Comment J'ai compris que l'on devait choisir un gène qui ne changeait pas mais dans l'exemple vu en cours le professeur a expliqué que par exemple dans 3 échantillons (une référence, une condition 1 et une condition 2) on avait une quantité totale d'ARN égale mais une quantité d'ARNm à quantifier et d'ARN du gène standard en quantité différente.  [...] Ce que tu vas donc faire c'est faire une qPCR pour quantifier le TGFB et un gène de ménage (ex. GAPDH) dans chaque échantillon. Ensuite tu vas faire le delta CT entre la Ct du TGFB et celle de la GAPDH. Etant donné que tu as la même quantité totale d'ARN dans tes échantillons la Ct de la GAPDH ne devrait pas beaucoup changer (puisque c'est ton gène de référence) par contre celle du TGFB oui.  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] En theorie, si ton (tes) gene(s) de menage est solide, tu n'as meme pas a quantifier l'ARN au depart puisque ton gene de menage va te normaliser tes resultats entre tes differents echantillons. En plus, c'est nettement plus precis qu'une quantification par la DO280 qui va quantifier a 95% des ARN stables et non pas des messagers.  [...]

[Biologie Moléculaire] les ARNs et extraction

Les échantillons sont déposés 2 fois mais à des quantité différente (les puits d'en haut contiennent moins de quantité d'ARN que les puits d'en bas). Je ne vois qu' un smear et dans tous les autres cas on ne distingue rien. Ceci est lié à une dégradation de l'ARN Peut-on dire qu'il y a contamination avec de l'ADN ou des protéines comment expliquer que dans un cas il y a un smear et que lorsque que l'on en dépose plus il n'y a rien merci de vos réponses.  [...] En fait dans les premiers puits en haut on a mis 1ug d'ARN après dilution (on le calcule a partir de la DO) et dans les puits d'en bas sont les mêmes échantillons avec 1µL de solution d'ARN (ça doit faire à peu près 10 µg). Il y a plusieurs puits car plusieurs dépôts on été fait à partir de plusieurs extraction (test de la répétabilité de la méthode).  [...]

[Biologie Moléculaire] extraction d'ARN

J'ai juste remarqué qu'en travaillant sur des échantillons congelés dans le TRIzol, j'avais un meilleur rendement que si je les traitais de suite après le prélèvement. Le fait de chauffer les échantillons pour favoriser la dissolution des sels avant extraction augmenterai mon extraction d'ARN.  [...] Juste pour vous dire que j'ai retenté une extraction d'ARN en faisant un lavage supplémentaire au chloroforme et mon rapport DO 260/230 est passé de 0,4 à 1 donc nette amélioration. J'ai dû cependant compenser la perte de rendement d'ARN en partant d'une quantité d'échantillon de 30% supérieure.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent: préparer gamme pr qRT-PCR

Je veux faire une qRT-PCR, pour tester mes primers que j'utilise pour la 1ère fois, on m'a dit qu'il faut que je réalise une gamme de mes cDNA. Ma collègue partait d'un échantillon à 2,1 µg d'ARN total, après la RT elle commence par diluer les cDNA au 1/4 puis au 1/10, 1/50, 1/100, 1/150.  [...] Mon échantillon est moins concentré en ARN ~0,6 µg (échantillons rares), donc je me dis que je devrais le diluer au 1/2 puis faire ma gamme, est-ce suffisant j'ai besoin de vos conseils car comme je l'ai dit les échantillons sont rares et je voudrais pas rater cette manip,  [...]

[Biologie Moléculaire] Micro ARN

Voici le protocole que j'utilise pour extraire les ARN te miR d'echantillons de peau.  [...] Extraction chloroforme (Attention en recuperant le surnageant a ne pas vouloir trop en recuperer au risque de contaminer ton echantillon).  [...]