• Santé - ADN, Plasmide, Contrôle

[Biologie Moléculaire] PCR: dépôts qui restent dans les puits lors de la migration

Je suis actuellement en train d'essayer de cloner un gène muté de 5kb dans un vecteur. Pour celà, je dois préalablement réaliser des PCR à partir de l'ADN du patient. Ces PCR se font en deux étapes.  [...] Piste 3. Controle positif (50ng du plasmide contenant le gène wt). On y devine bien une bande au bon PM, mais celle-ci reste bien trop faible pour être purifiée (et le but est de purifier la bande pour l'ADN patient).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Nous avons fait une clonage d'un ADNc dans un plasmide... En parallèle, nous avons fait un contrôle négatif qui contenait le vecteur mais sans insert (l'insert étant remplacé par de l'eau distillée). J'aimerais savoir à quoi sert exactement le contrôle négatif.  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

La Q PCR c'est établir une gamme étalon d'un ADN controle ( Quantité d'ADN au départ connu) généralement un plasmide avec 1000, 10 000 100 000 et enfin 1 000 000 copies et définir pour chaque quantitées le nombre de cycle néssaires pour avoir un signal différent du bruit de fond (le cT) celui-ci est donc inversement proportionnelle à la quantitée d'ADN du départ.  [...] Ton plasmide, comment est tu sur qu'il est à 1000 copies et pas 1500 ou 2000 copies. Dans ce cas tu es relatif à ton nombre de copies qui n'est pas si absolue que ca.  [...]

Plasmide

Ensuite, je fais une miniprep d'ADN plasmidique. et il ya cette phrase que je ne comprends pas le plasmide est contrôlé par digestion et par PCR.  [...] La selection des plasmides recircularisés se fait lors de la transformation de cellules électrocompétentes. Seules les cellules ayant reçu un plasmide recircularisé pourront croitre sur le milieu sélectif car seulement ces plasmides peuvent coder pour le gène de résistance en question (la sélection doit se faire sur Ampicilline je suppose ).  [...]

transformation e.coli par le plasmide pglo

Tu fais ta transfo (tu la fait bien biensur sinon ça risque pas de marcher) puis tu incube overnight. Et le lendemain tu compte le nombre de colonie positives en fonction de ta selection puis tu calcul la quantité de plasmide que tu a utilisé pour la transfo.  [...] Là tu es donc à 0.05µg/µl (puisque j'ai considéré que tes 400µg d'eau stérile c'est enfaite 400µl d'eau stérile LOL) Et donc si ta fait la transfo classique 10µl plasmide + 40µl cellules alors ta étalé 0.5µg de plasmide. Donc si t'a compté 600 colonies admettons, alors l'efficacité c'est.  [...]

[Génétique] plasmide ADN distinct de l'ADN chromosomique

j'ai pas bien compris la définition du plasmide,surtout quand ils disent que c'est une molécule d' ADN distinct de l'ADN chromosomique.  [...] Les plasmides sont des molécules d'ADN, généralement circulaires, et capables de réplication autonome, que l'on trouve surtout chez les bactéries. Ils existent dans le cytoplasme en plus du chromosome cellulaire (d'où le distinct dans ta définition) comme tu peux le voir ici.  [...]

Asthme allergique : bientôt un vaccin intramusculaire efficace ?

Les chercheurs ont d'abord tenté de prouver l'efficacité de cette vaccination à base d'ADN contre l'allergène spécifique, Derf1, dans un modèle animal pertinent mis au point par l'équipe Pathologies bronchiques et allergies dirigée par Antoine Magnan. En Europe, Dermatophagoides farinae 1 (Derf1) est en effet un allergène très commun véhiculé par l'acarien Dermatophagoides farinae.  [...] Cette illustration montre la façon dont les chercheurs ont procédé pour réaliser l'expérience. À partir de l'ADN de l'allergène, ils ont pu placer le plasmide dans un nanovecteur. Une fois injecté, cet ADN sera traduit et transcrit en protéine contre laquelle le corps va produire des anticorps qui n'induiront pas d'allergie. B. Pitard.  [...]

[Biologie Cellulaire] probleme de transfection

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu'on étudie et qui contrôle l'Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.  [...] Problème. une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m'aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j'ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c'est stupide. Mais quand on panique….  [...]

Hybridations plasmides et sondes

Cette manip te permet de visulaiser quelles colonies (et donc quels plasmides) contiennent ta sequence d'interet (tu auras un spot noir sur ta photo). Ensuite, il ne te reste plus qu'à recuperer les colonies identifiées sur ta deuxieme boite de petri (identique à ta membrane de nitrocellulose puisque replique), a les relancer en milieu liquide pour en extraire l'ADN plasmidique (manip 2).  [...] En revanche, un phage n'est absolument pas plus propre qu'un plasmide, et je dirais meme qu'il est beaucoup plus sale dans la mesure ou d'une part tu ne controles pas du tout l'ADN encapsidé (à la difference du plasmide) et d'autre part, le phage est vivant par lui meme, ce qui fait que tu ne controles pas toujours à 100% son cycle.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Ensuite, as-tu fait des contrôles J'entends par là. as-tu électroporé ton plasmide tout seul que tu étales ensuite C'est un témoin indispensable Puis, as-tu pensé à étaler tes ligations sur des boîtes sans antibio Qui sait, peut-être qu'il y a un problème d'expression de la résistance et tu te retrouves avec des sensibles donc aucune colonie.  [...] Logiquement, tu auras un vecteur religué sur lui-même, donc un ADN double-brin circulaire qui a un pouvoir transformant. Ce contrôle te permet de savoir quelle tête auront les faux positifs, càd ceux qui auront intégré un plasmide sans insert.  [...]