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[Biochimie] Conservation d'anticorps

J'aimerais savoir si certains d'entre vous ont une expérience en terme de milieu de conservation d'anticorps. je purifie des anticorps à partir de sérums humains, mais la conservation en glycérol ne préserve pas l'activité de mes anticorps dans le temps. Pour être plus précis, les anticorps que je purifie sont destinés à de l'immunocapture, mais au bout de quelques jours seulment l'activité biologique d'immunocapture disparait alors que mes anticorps sont toujours fonctionnels en western blotting ou en immunofluorescence.  [...] Je conserve mes anticorps aliquotés congelés à -20°C en PBS. Quand je décongèle un aliquot, je le garde à 4°C. Je n'ai, en général, pas de problème pour mes applications (FACS, WB, immunofluorescence). Je ne fais pas d'immunocapture et je ne peux donc pas répondre à des questions qui seraient spécifiques à cette technique.  [...]

Immunoblot

Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité).  [...] Et en effet l'utilisation d'un anticorps secondaire reconnaissant l'anticorps primaire est désormais utilisé la plupart du temps (pour ne pas dire tout le temps ), mais là encore j'ai voulu simplifier pour que ce soit compréhensible, en introduisant en même temps la notion de détection par anticorps couplé à une activité physique, chimique ou biochimique détectable.  [...]

[Immunologie] Question de mon examen d'immunologie

Une autre méthode consiste à faire un western blot des cellules exprimant ton récepteur activé par le PDGF, avec un anticorps dirigé contre une phospho-tyrosine d'un substrat de l'activité kinase du PDGFR. Si tu observes une stimulation du signal entre la condition ou le récepteur n'est pas activé et la condition ou PDGF a été ajouté, c'est que ton récepteur est fonctionnel.  [...] Un biais persisterait, c'est que cette phosphorylation détecté par l'anticorps anti-phospho-tyrosine du substrat pourrait très bien être catalysée par une autre kinase indépendant de la voie du PDGFR. Dans ce cas, tu peux faire le même western blot sauf que tu y ajoutes une condition siRNA COntrol et siRNA PDGFR (enfin là ça commence à devenir très pointilleux tout de même, un essai kinase ou un western blot simple devrait suffire ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Anticorps GLUT2 pour Western Blot

J'aimerais avoir votre avis sur un petit problème que je rencontre actuellement au laboratoire. Voila je fais des Western Blot depuis un bon moment mais impossible de trouver un anticorps GLUT2 assez potable. En effet beaucoup me donne des bandes non spécifiques.  [...] D'accord Merci a vous, je vais regarder cela en attendant d'autre réponse. J'essaie tant bien que mal de trouver l'anticorps le moins mauvais possible.  [...]

Immunohisto

L'anticorps peut +/- bien marcher en western-blot par rapport a l'immunohisto (ou cyto-)-chimie. Les tampons sont differents, les conditions aussi...l'interaction epitope-site anticorps etant conditionne grandement par des interactions ioniques-electrostatiques, les tampon, pH, ions (...) jouent pas mal.  [...] Cependant. 1) en western, si l'anticorps est suppose reconnaitre un site qui peut etre modifie (phosphoryle, clive, episse, acetyle, palmytoyle...), il se peut que en fonction du tissu, la proteine soit ou non modifiee a cet endroit et donc ne lie plus aussi bien l'anticorps en western-blot.  [...]

Différence de fixation des cellules

Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique.  [...] ..) et certains fonctionnent pour plusieurs d'entre elles. L'anticorps que j'utilise en routine fonctionne aussi bien en western qu'en IF.  [...]

Problème RT-PCR sur cDNA

Par la façon dont tu exposes ton problème, j'ai l'impression que tu ne connais pas la structure exacte intron/exon de ton gène... J'imagine que c'est pour ça que tu séquences le cDNA. Une chose est sûre. entre les prédictions des sites d'épissages et une preuve biologique (ADNc séquencé), c'est la preuve biologique qui gagne.  [...] Une autre possibilité. un Western Blot avec un anticorps specifique du peptide que donnerait cet intron s'il était traduit. Si le Western est positif alors tu auras prouvé que cet intron est inclus et tu pourrais même estimer la quantité avec un anticorps contrôle spécifique d'une autre partie de ta protéine.  [...]

[Biologie Cellulaire] Qui à déjà utilisé le système SNAP i.d. de Millipore pour ses Western Blot?

C'est seulement lorsqu'un anticorps est déjà un peu limite en western normal que là le SNAPid risque de donner un résultat encore plus moche en terme de spécificité. Mais c'est rare.  [...] nous aussi on s'y est mis et franchement ca marche super bien. Comme dit précédemment, les anticorps un peu pourris en blot classique resteront bof mais ceux qui tournent bien marchent sans pb.  [...]

[Biochimie] Etude de la phosphorylation d'une protéine

Vu que j'ai l'anticorps contre ma protéine, je pensait faire une immunoprécipitation pour ensuite réaliser un blot anti ser/thr/tyr phorsphorylées. Ou l'inverse (IP anti ser/thr/tyr suivi d'un WBlot contre ma protéine).  [...] En fait je pensais aussi faire un western sur ton gel avec des anticorps anti-Ser/Thr/Tyr phorsphorylées et anti- ta-protéine. Je n'ai jamais fait de 2D mais je sais que ça se fait. Et puis pour les grosses protéines ont peut aussi faire des gels d'agarose, au moins pour la première dimension.  [...]

[Immunologie] Production d'anticorps polyclonaux

je souhaiterai faire produire des anticorps polyclonaux pour une manip de western blot contre une protéine membranaire de souris pour laquelle le seul anticorps existant n'est pas du tout spécifique.  [...] Est-ce que quelqu'un a déjà commandé des anticorps à la demande Et si oui pouvez-vous me donner une idée du prix (de la synthèse du peptide à la livraison de l'anticorps, purifié ou non, ou du serum) ainsi que le nom de la boite.  [...]