• Forum - Western, Forme, Protéine

besoin d'aide pour technique direct blot and following immonoprecipitation

Le but est de rechercher une forme tronquée d'une protéine. le texte est en anglais et dit que la technique utilisé est. direct blot and following IP. Je préfère le mettre en anglais car je ne sais pas trop comment le traduire et je pense que c'est plus clair comme ça.  [...] Je pense qu'ils font d'abord une immunoprécipitation de la protéine d'intérêt puis un western blot pour séparer la forme sauvage d'une éventuelle forme tronquée. l'expression employée me fais plutôt penser que le marquage (blot) est fait en premier et l'IP ensuite.  [...]

pro-caspase 12 et caspase 12

C'est pour cette raison que quand on interprète un western blot c'est plutôt la caspase clivée qu'il faut regardé vu que c'est la forme active de la proteine.  [...] dans le western blot y'a P-JNK et t-JNK ça correspond à la JNK totale et la JNK phosphorylée c'est bien ça et phosphorylée c'est la forme active de la proteine c'est bien.  [...]

[Biologie Cellulaire] Traduction d'une protéine avec codon stop prématuré

J'aimerai regarder par immuno l'extinction de cette protéine. Mon anticorps qui détecte l'enzyme non muté cible la zone Nterminale.  [...] TOn anticorps va détecter forcement la forme tronquée (sauf si elle est éliminée trop rapidement en effet). Mais ce que je n'arrive pas a comprends c'est comment tu peux espérer voir l'extinction de ta protéine par western.  [...]

Mapk P38

Hello est ce que quelqu'un a déjà essayé de différencier par un Western la protéine P38 et cette même prot sous forme phosphorylée En gros est ce que je peux mettre mes deux anticorps primaires en même temps et voir apparaître 2 bandes Je fais des gels d'électrophorèse à 12%, est ce que la résolution est assez forte.  [...] Si ta proteine est multiphosphorylée oui tu peux faire ca, normalement les proteines phosphorylées migrant plus lentement tu observera des bandes superieures. Il faut etre sur que les bandes inferieures ne sont pas des produits de degradation (donc un témoin traité a la phosphatase alcaline est essentiel).  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Il y a la théorie mais après il y a la pratique. Moi sur mes Western, quand je regarde ma protéine, j'ai deux bandes. une qui est la forme normale, une autre très légèrement au-dessus qui est la forme hyperphosphorylée...La phosphorylation retarde la migration électrophorétique, c'est illogique car, comme tu l'as dit, le phosphate apporte deux charges négatives.  [...] D'ailleurs j'en profite, pour une question a LXR qui bosse avec une grosse protéine, on travaille sur une protéine de 312KDa mais on a bcp de mal a la voir en western, est-ce qu'il y a des astuces de protocole quand on bosse avec des protéines de cette taille la.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

Et, ATM est une grosse protéine, très peu abondante. Y a t-il une méthode d'extraction à privilégier de migration et de transfert.  [...] Je plussoie infiniment piwi, certains de mes westerns (concernant des protéines peu exprimées) se sont résolus simplement en chargant moins (par exemple 120µg avant, 10 après).  [...]

[biologie moléculaire] Info sur le slot blot

L'avantage su slot blot, c'est bien sur la rapidité de la manip. Par contre, le western blot apporte une information supplémentaire, la masse de la protéine liée par l'anticorps. Cela peut être très utile pour éviter d'avoir des faux positifs. si tu cherches une protéine de 30 kDa et que ton western révèle une protéine de 80 kDa, tu sais que c'est un faux positif. En slot blot, tu ne le sauras pas.  [...] Ca peut aussi être interessant quand tu as des modifications post-traductionnelles. En western, tu pourras par exemple voir que seule une forme phosphorylee d'une proteine est reconnue, ce qui peut etre interessant d'un point de vue fonctionnel.  [...]

[Biologie Cellulaire] poly-ADP-ribosylation de protéines

L'anticorps anti-PAR est une bonne alternative même si cela reste une démonstration indirecte de la PAR de ta protéine. Dans ce cas, je ferais une IP anti-ta protéine suivie d'un western blot anti-PAR pour démontrer qu'elle est PARée.  [...] Comment souhaites-tu inhiber les PARP Inhibiteur ou siRNA Dans ce cas, une condition sans inhibiteur/siRNA et une avec inhibiteur/siRNA avec IP anti-ta protéine et western blot anti-PAR et la démonstration sera correcte, je trouve, au niveau fonctionnel. Peut-être que dans les publications cela leur suffit comme manip, mais il serait plus rassurant d'ajouter un marquage métabolique et/ou une spectrométrie de masse dans la mesure du possible (collaboration avec une plate-forme ou un labo intéressé...).  [...]

Co-Immunoprecipitation

J'ai une question très naïve... Lors d'une co-immunoprecipitation, dans le lysat, on se retrouve avec une protéine A que l'on précipite qui est liée avec son partenaire B que l'on détecte en western blot. Cependant si dans les cellules/tissus lysés il y a une portion de A et de B qui ne sont pas liés ensemble, est ce que le complexe A-B peut se former après lyse des tissus (dans mon tube) En conséquence, est ce qu'une co-immunoprécipitation peut être quantitative c'est à dire est ce que dans deux coditions expérimentales on peut dire si la portion de complexe A-B augmente par rapport aux forme A et B libres.  [...] En effet, le volume utilisé de lyse/d'IP est très largement supérieur au volume de cellules initial, et en conséquence, la concentration en protéine A et B est largement inférieure dans le lysat que dans la cellule, ce qui déplace l'équilibre du côté de la dissociation.  [...]

[Immunologie] immunoprécipitation

Dans la co immuno, tu va piocher avec un 1er anticorps ta 1ere protéine que tu soupçonne d'interagir avec une 2eme protéine. Ensuite a partir de ce complexe Anticorps/protéine que tu as purifié tu va essayer de detecter la 2eme protéine par un Western blot.  [...] Si tu a apparition d'une bande sur ton Western avec l'anticorps anti 2eme protéine c'est qu'elle est présente en meme temps que protéine 1, si pas de bande c'est que non.  [...]