• Forum - Western, Expression, Protéine

RT PCR et après ....

J'ai réalisé à cet effet une RT-PCR suivie d'une PCR, après avoir fait un gel d'agarose, faut-il que je fasse autre chose pour pousser plus avant cette inspection de l'expression de mon gène.  [...] J'oubliais de dire, qu'une autre facon de tester l'expression de ton gene, est de verifier la presence de la proteine par western blot. en comparant cela avec les proteine d'une cellule non transfectee. Cela necessite, cependant, d'avoir des anticorps contre ta proteine, ou d'avoir ajouter un tag a ta proteine.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

sachant que l'objectif du travail est de transfécter des cellules eucaryotes par un vecteur d'expression pour étudier les fonction d'une protéine par western et immunofluorescence.  [...] La suite est un peu plus floue, je reconstruit. Vous avez fait votre mutagénèse en bluescript (vecteur de clonage). Vous souhaitez exprimer votre insert dans des cellules de mammifères. Il vous faut donc un vecteur d'expression eucaryote. Du coup le transfert Bluescript -.  [...]

mesure de l'expression d'un gene

Merci pour la réponse, on pourrait peut etre faire dans ce cas des dosages d'expression de la protéine par Western ou par tout autre méthode utilisant des anticorps.  [...] Je confirme que pour analyser rapidement la taux d'expression d'une protéine particulière, on utilise le western blot (WB). C'est une technique facile à mettre en oeuvre, éprouvée, qui permet de faire des comparaisons très rapidement (plusieurs échantillons en même temps) et relativement rapide.  [...]

[Biologie Moléculaire] MicroARNs et modes d'actions

Je suis actuellement doctorant et j'étudie l'expression des microARNs au niveau de cellules épithéliales intestinales murine.  [...] En effet dans de nombreux articles les variations d'expressions des microARNs mesurées sont assez faibles mais la diminution l'expression de la protéine est nettement visible en western blot.  [...]

[Biologie Cellulaire] Cytométrie

salut a tous, quelques petits soucis... quelles est la différence entre FACS et cytométrie en flux et quel est l'avantage de cette technique par rapport au western blot quand il s'agit de comparer l'expression d'une protéine entre 2 populations merci de vos réponses.  [...] ok merci beaucoup. et est ce que par exemple il est possible à partir d'une population d'identifier 2 sous groupes et de les récupérer séparement à la fin pour les remettre en culture.   [...]

besoin d'aide pour technique direct blot and following immonoprecipitation

Mes connaissance dans le domaine de l'immunoprécipitation et du marquage de protéines sont assez limitées et j'aurais besoin d'aide pour comprendre une manip.  [...] Je pense qu'ils font d'abord une immunoprécipitation de la protéine d'intérêt puis un western blot pour séparer la forme sauvage d'une éventuelle forme tronquée. l'expression employée me fais plutôt penser que le marquage (blot) est fait en premier et l'IP ensuite.  [...]

[Biologie Moléculaire] siRNA

Normalement si le siRNA est correctement conçu, à ma connaissance, un seul est suffisant. Je pense qu'il est même préférable d'en utiliser un seul. En revanche lors de la commande de SiRNA il arrive que le fabriquant fournissent 4 siRNA à tester peut être est ceux à quoi tu fait allusion.   [...] Pour tester l'efficacité tu peux réaliser une qPCR sur le gène cible du SiRNA l'ARN étant dégradé si le siRNA est éfficace. Tu peux aussi faire un Western Blot pour observé que l'expression de ta protéine est bien éteinte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

Je suis d'accord avec Delphinette. Après, la méthode à utiliser dépend de ce que tu veux faire. Si c'est pour une expression transitoire, il est beaucoup plus simple d'utiliser un liposome, car même avec un taux de transfection très faible, tu peux voir ta protéine exogène facilement en western-blot.  [...] Cependant sur le manuel de Promega il est dit que ce plasmide peut exprimé la protéine d'interet (que l'on aura eu soin d'intégrer) de manière transitoire ou permanente... Si c'est la séquence du plasmide qui permet ou pas son intégration dans l'ADN de la cellule, comment obtenir ces 2 sortes d'expression (transitoire/permanent) Quel facteur supplémentaire entre en jeu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

Dans le but de mettre en évidence des différences dans l'expression de la Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (une protéine de réparation de l'ADN) chez des cellules soumises à différentes concentrations de drogue X, j'effectue des Western Blots.  [...] Suite à quelques problèmes (impossible de mettre en évidence ladite protéine), j'ai décidé d'inclure une étape de sonication pour découper l'ADN des échantillons cellulaires.  [...]

[Biochimie] Purification de protéine recombinante de faible PM

Normalement, faire un western afin de valider la production de la protéine dans le système d'expression est la première chose à faire. Cela peut éviter de gaspiller inutilement le matériel nécessaire à la purification de la protéine.  [...] Je ne suis pas tout a fait d'accord. Tu DOIS voir ta proteine en coomassie. Si tu ne la vois qu'en WB tu peux considerer que l'expression n'est de toute facon pas suffisante pour une purif alors il faut travailller les conditions d'induction, rien ne sert de depenser ton temps et ton energie en WB.  [...]