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Mammalian Expression Vectors

J'aimerai savoir si quelqu'un pouvait me conseiller un vecteur d'expression pour mammifère dans le but de sur-exprimer un gène de façon stable dans des cellules humaines. Un vecteur non inductible et taggé à l'eGFP ou à la luciférase serait le top. En effet, il en existe un grand nombre sur le marché et je ne sais lequel choisir.  [...] J'ai cloné un cDNA humain d'un gène codant un facteur d'épissage alternatif dans un vecteur et je l'exprime en stable dans des cellules C2C12 (souris). Et bien mon taux d'expression de l'exogène est extrèmement faible par rapport à l'endogène de souris, et ça en ARN et prots.  [...]

[Biotechnologie] Fabrication d'une protéine d'intérêt ?

Il manque une étape entre la production du cDNA et la transfection dans les cellules. Le cDNA est inséré dans un vecteur d'expression qui contient outre les éléments classiques d'un vecteur (Ori, MCS, marqueur de sélection) un promoteur de transcription ainsi qu'un RBS (ribosome binding site) qui va permettre la traduction du transcrit.  [...] Ensuite vous faites votre transfection de bactéries ou de cellules eucaryotes. A noter que pour les cellules eucaryotes il existe deux types de transfection, stable (le vecteur s'insère dans le génome de la cellule) ou transitoire (le vecteur reste séparé du génome et finira par être éliminé).  [...]

[Biotechnologie] RNA interference : siRNA, shRNA

En culture cellulaire, si le vecteur est un plasmide, il ne s'intègre pas dans le génome mais peut se répliquer. Cependant il risque d'être expulser si il n'y as pas de pression de sélection comme une résistance à un antibiotique. Le moyen le plus sure de faire une lignée stable est d'utiliser un vecteur lentivirus, qui intègre la séquence du shRNA (ou de n'importe quel gène) dans le génome.  [...] En effet le shRNA a besoin d'un promoteur et d'autres séquences pour s'exprimer (moins ready to use que le si). On peut effectivement l'intégrer dans un vecteur adénoviral (qui ne s'intègre pas. effet transitoire) ou lentiviral (qui s'intègre, donc effet stable si on utilise une sélection des cellules ayant intégré le vecteur) ou AAV.  [...]

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

Il arrive que le vecteur contenant l'ADNc (dans ton cas l'ADNc (pas ARNc, les vecteurs sont a ADN en majorité (sauf certains vecteurs viraux)) codant les recepteurs de ta cellule, sous le controle d'un promoteur fort, permettant une forte synthèse de l'ARNm correspondant) pour le gène d'intérêt ne comporte pas de gène de resistance à des antibio eucaryotes.  [...] Pourquoi ne pas faire un stable qu'avec le vecteur codant les recepteurs et cultiver en dilution limite pour établir des clones à partir de cellules isolées sachant que la proba d'intégration est de moins de 1 sur 1 million, ce serait impossible de trouver rapidement un clone stable.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

Tu peux faire une lignée stable avec la lipofectamine, c'est juste que le taux de cellules transfectée est faible, et le taux de cellules ayant intégré l'ADN encore plus faible... D'où le moins rapide/moins efficace. Car avec un vecteur viral, tu auras beaucoup plus de cellules transduites et si c'est un vecteur intégratif, tes cellules qui auront été transduites vont intégrer efficacement cet ADN, ce qui n'est pas le cas avec la lipofectamine qui ne pemret pas d'intégrer l'ADN.  [...] Les cellules font aussi des recombinaisons heterologues. Pour les selectionner, on utilise generalement de la puromycine (le vecteur possede le gene de resistance). Alors seules les cellules qui auront intégré aleatoirement ce plasmide dans leur chromosome pourront survivre. On obtient donc des lignées stables.  [...]

[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient.  [...] J'ai eu le même problème avec des stables (C2C12, cellules de souris) -. Résistance exprimée mais quasiment pas de prot exogène, alors que no problem en transitoire. J'en ai déduis que ça venait du fait que la prot qu'on a cloné soit importante pour la cellule, et que le fait de la surexprimer pouvait avoir un effet négatif sur les cellules, et du fait la sélection favorisait les cellules exprimant peu.  [...]

Stratégies d'insertion de fusions de gènes

Tu parlais du fait que lorsqu'un gène important est inactivé on a la mort de la cellule (plus ou moins ça). Dans ce cas on peut utiliser la mutagénèse conditionnelle et donc là c'est du dirigé. Maintenant, on utilise le plus souvent le système Cre-LoxP. On flanque un gène ou un exon de sites LoxP dans des cellules possédant la Cre recombinase sous contrôle d'un promoteur inductible.  [...] Pour que l'insertion soit stable, comment tu fais si tu ne maintiens pas la pression de sélection notamment dans le cas d'insertion via des transposases J'arrive à comprendre qu'une insertion via un plasmide vecteur et recombinaison homologue reste stable, mais le propre de l'élément transposable n'est-il pas justement de transposer La cellule a t-elle intérêt à maintenir une insertion qui ne lui apporte rien (c'est un peu finaliste comme question, mais c'est vrai.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs intégratif+inductible

ce qui m'étonne un peu, c'est que souvent en transitoire, il y a plusieurs copie du vecteur par cellule, donc l'expression est plus forte qu'en stable. Dans mon cas, j'observais souvent une réduction de l'expression apres etre passé en stable.  [...] Enfête justement pour le moment je n'aie pas téstés ni la GFP ni le système inductible. Ce qui ne marche pas pour moi c'est un vecteur avec un promoteur non inductible et sans tag il contient un gène de resistance néo.  [...]

[Biologie Cellulaire] La cellule mystère.... - Page 6

Ces MDCK sont une lignée stable pour l'actine GFP. Enfin relativement stable car les cellules du haut n'ont pas un niveau d'expression au-dessus du seuil de détection.  [...] Dans ma fac les profs de bio cell ont le chic pour trouver tout plein de ptites video rigolotes En tout cas cette histoire de bactérie qui se construisait un petit moteur pour se ballader de cellules en cellules m'avait marqué.  [...]

[Biologie Moléculaire] Faire du pGEMT soi-meme

vecteur pGEMT. je l'ai récupéré dans une colonie bleu, je l'ai ouvert avec EcoRV et maintenant il faut que je rajoute un T aux extrémités. Pour cela j'ai une Taq et des dTTP mais je ne sais pas quel programme PCR utiliser. Combien de cycles a quelle température d'hybridation quelle durée d'élongation.  [...] Pour ma part je partirais sur une strategie differente. Tu peux faire une amplification lineaire (50 a 100 cycles avec une enzyme HF et tres thermostable) d'un plasmide avec une amorce contenant un T sortant. En 2 PCR tu as assez d'ADN simple brin pour reformer une grosse quantitee de vecteur.  [...]