• Forum - Vecteur, Site, Clonage

Manipulations génétiques

Pour intégrer un gène d'intéret dans un génome, c'est assez compliqué, je me ferai un plaisir de t'expliquer si tu connais les notions de PCR, séquences nucléotidiques complémentaires, arn polymérase, plasmide, vecteur, recombinaison homologue ^^.  [...] Ensuite tu peux insérer ton gène dans un plasmide vecteur (procédé encore compliqué, avec des notions de multi site de clonage etc etc ^^).  [...]

exercice de génomique assez complexe..

Soit une séquence d'ADN (bicaténaire) constituée de TCTAGA, site de restriction reconnu par l' endonucléase de restriction XbaI.  [...] Quels seraient les sites de clonage susceptible d'insérer cette séquence d'ADN, parmi les site de clonages suivants, qu'on supposera présents chez un vecteur quelconque.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs de clonage

Ceux qui n'en ont pas sont à éliminer. Ensuite, il faudra que vous verifiez 1. qu'un des sites de restriction de la cassette de clonage peut être utilisé (le site de restriction ne se trouve pas dans votre séquence codante), et 2. que ce site permet un clonage en phase avec un éventuel start de transcription présent sur le vecteur (vérifier aussi si il y en a un ou pas d'ailleurs).  [...] Si les deux derniers points ne sont pas réunis, il vous faudra faire quelques adaptations durant votre clonage (créer un site de clonage, adapter des amorces PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] difficulté plasmide lentiviral

J'ai un problème de clonage d'un petit oligo (shRNA) dans un vecteur lentiviral qu'il faut digérer AgeI/EcoRI pour le site de clonage. Sauf que mon problème se révèle bien plus basique que cela, après quelques déboires, je viens de me rendre compte que je n'arrive même pas à obtenir des clones après transfo de mon plasmide simplement digéré EcoRI OU AgeI et religué sur lui-même.  [...] .. Le plasmide non digéré se transforme sans problème même si après une nuit à 37°C les clones sont assez petits. Pour info, il est conseillé d'utiliser des bactéries déficientes pour la recombinaison avec ce plasmide, donc j'ai utilisé des SURE2. Je précise aussi qu'après avoir constaté que j'avais un problème basique dans ma ligation, je l'ai refaite avec nouvelle ligase et nouveau tampon de ligase et.   [...]

[Microbiologie] Taille de plasmide

svp je demande pour la taille de plasmide, j'ai trouvé cette unité (MDA ) je veux savoir sa signification, et 1MDA = combien de Kilobase.   [...] C'est facile pGEM-T est un vecteur de sous-clonage commercial. La carte plasmidique est disponible sur internet. A partir de là un enfant de 6 ans trouverai le nombre de site de restriction pour ces 3 enzymes.  [...]

[Biologie Moléculaire] précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

encore plus étrange, je coupe ma bande de 2000pb je la rentre dans un vecteur pGEM-T et je fais des PCR avec les amorces T7 et SP6 qui encadrent le site de clonage. et là j'ai des bandes à 1000pb.  [...] tu as un vecteur de 6kb que tu as ouvert. A ce moment, ton gel te confirme sa taille de 6 kb. Après une nuit dans de l'éthanol, ce même plasmide ne fait plus que 2kb. Tu récupères ce fragment, tu l'intègres dans un autre vecteur, puis tu fais une PCR sur ce fragment, et là 1kb.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Je commence actuellement une construction pour generer un nouveau modele de souris transgenique. J'en suis seulement a la construction du vecteur et je me pose la question suivante. Je dois effectuer un clonage d'un fragment d'environ 700pb dans un plasmide au niveau d'un site EcoRI.  [...] Merci beaucoup. Et apparemment le traitement a la CIP de mon vecteur n'empechera pas la ligation evec l'insert de s'effectuer car il me semble que la ligase T4 peut liguer des terminaisons phosphorylees (celles de mon insert) aux terminaisons non phosphorylees (de mon vecteur).  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

oui en effet il doit y avoir des séquences prévues pour amplifier une partie du vecteur contenant l'insert, ou bien tu peux designer des amorces pour le faire. par exemple une avant le site de clonage, une dans ton insert. Il y a aussi beaucoup plus rapide.  [...] la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...]

Traduction de termes anglais issus d'un article.

Pour FLAG c'est aussi ce que j'aurais dit à la base, mais dans l'article avec un petit Ctrl+F toutes les apparitions de FLAG se font quand ils nomment le vecteur (pCMV-FLAG), je l'ai pas retrouvé en dehors du vecteur, pour designer la protéine, donc pas sur que dans le contexte ca soit ca, si (pas lu l'article en entier).  [...] si c'est ca. En fait il existe des vecteurs ou le tag (flag, 6his, myc, ou autre) est déjà là, en amont ou aval du site de clonage, du coup en intégrant ton cDNA en phase dans ce vecteur tu peux directement produire une protéine de fusion. Pratique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Tp biomol

Ensuite au TP2 on a effectue un clonage moleculaire. Alors au depart on avait un vecteur compose de pBluescript digere par EcoRI et un melange avec pBluescript digere par ECORI pBR(eco4)(compose de pBR322 et 4 segments d'ADN de 300pb clones au site de restricition) digere aussi par ECORI.  [...] On a purifie le vecteur et le melange pour eliminer les enzymes de restriction et ensuite on a effectue 3 depots sur un gel d'agarose. le vecteur, le melange sans ligase et le melange avec la ligase T4. Deja a cette etape je ne comprends pas tres bien le but de cette electro et ce qu'on devrait avoir.  [...]