• Forum - Vecteur, Résultats, Enzyme

Si on n'inactive pas la phosphatase...?

J'ai une petite question SVP, quand j'ai fait une déphosphorylation d'un vecteur plasmidique j'ai oublié à la fin d'inactiver la phosphatase et juste après j'ai effectué une ligation alors vais-je avoir un problème dans mes résultats à cause de l'inactivation de l'enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Il me semble que nous en avions pour notre clonage environ 800 colonies pour 60 ng d'insert et pour le controle nous en avions environ 100, je n'ai pas encore les résultats exactes.  [...] Nous n'avons fait que le controle vecteur sans insert avec ligase, donc du coup j'étais pas mal perturbé mais une fois qu'elle m'a expliqué leur manip et leur résultats, tout a été plus simple (grâce à vos aides aussi, évidemment).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

-les passages du gène d'intérêt dans le premier vecteur et le passage du premier vecteur au second, ne nécessitent pas d'amplification PCR avec la Taq... donc pas d'incorporation d'erreur de nucléotide par cette enzyme.  [...] ça revient au même qu'avec les enzymes pour l'insertion dans ton second vecteur sauf que là encore, tu n'a pas besoin de rédigérer ton fragment à partir de ton premier plasmide pour le mettre dans un plasmide d'expression. Ici, avec le système gateway, ton plasmide d'entré va directement servir à la recombinaison avec ton second plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

J'ai testé l'enzyme ApaI sur un autre vecteur et elle coupe super bien.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

[Biologie Moléculaire] ADN complémentaire et PCR

3) Si nous avons un vecteur recombinant avec un fragment d'intéret et que nous souhaitons amplifier par PCR uniquement ce fragment d'intéret. en utilisant 2 amorces spécifiques des extrémités de ce fragment, faut-il.  [...] d'abord linéarisé le vecteur par un autre enzyme ou meme en le laissant circulaire, on ampliefiera seulement le fragment.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation Vecteur/insert après traitement CIP

j'ai une petite question de BM à vous poser car je bloque... voilà je fais actuellement du clonage dans mon labo, après digestion de mon insert et de mon vecteur avec une enzyme appropriée je CIP mon vecteur. J'aurai voulu savoir quel est le mécanisme de cette enzyme pour retire le 5'P et qu'il y ait un 3'OH à la place.  [...] Après, pour la ligation, je ne comprends pas comment elle peut avoir lieu entre l'insert et le vecteur si on a plus de 5'P au vecteur. La ligase utilise t'elle de l'ATP présent dans les buffer pour refaire des 5'P pour la ligature.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR de clones

Bonsoir, alors dans une même plaque de PCR, j'amplifie à la fois des lignées cellulaires (HT29, HCT116...) et des clones (vecteur PGEMt, e.coli, purif avec kit miniprep qiagen...). Résultats. mes lignées s'amplifient mais pas mes clones. C'est pourquoi je pense que mon protocole n'est pas si mauvais que ça, mes lignées s'amplifient.  [...] J'ai peut-être une idée mais bon. mes vecteurs ont peut-être une forme super enroulée empêchant leur amplification Je vais tester une enzyme de restriction pour voir si c'est ça ou pas. Qu'en penses-tu.  [...]

clonage fou!

En gros, j'ai inséré un gène dans un vecteur grâce à l'enzyme SalI, et malgré les clones qui sortent positifs par criblage PCR, il m'est impossible de ressortir mon insert.  [...] Pour info, je suis sûre et quasi certaine que mes clones ont bien intégré un vecteur recombinant. J'ai fait ma PCR de criblage avec un primer sur l'insert et un primer.  [...]

[Biotechnologie] PCR Vs Mini-prep (faite vos paris...)

En faite on fabrique un vecteur recombinant avec 3 inserts de taille différente. On transforme des bactéries et on les cultives sur boite de petri et l'on regarde le phénotype (les fragments d'ADN s'insert dans LacZ' dans le vecteur pUC19). Ensuite on extrait les plasmides pour faire une PCR et on fait en même temps une mini-prep pour comparer les résultats.  [...] Dans leurs question ils sous entendent qu'on doit avoir une différence dans nos résultats au niveau des quantités que l'on observe car ils veulent que l'on compare les résultats obtenus pour chaque techniques utilisées. Moi j'obtient la même chose à quelques exception mais après c'est de l'ordre de la mauvaise manipulation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

J'ai une chose que je comprend pas on choisit une enzyme qui ne coupe pas notre vecteur et qui doit être présente dans le polylinker de notre vecteur.  [...] j'ai trouvé deux enzymes (BamHI et SalI) qui sont présents dans le polylinker de mes deux vecteurs d'expression et qui ne coupent pas mon gènes comment je peux introduire ces deux site dans mes amorces pourque je puisse transférer après mon gène c'est à dire BamHI position 5' ou 3' de mes amorces et comment vérifier que mes amorces sont en phase.  [...]