• Forum - Vecteur, Promoteur, Résistance

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

Il arrive que le vecteur contenant l'ADNc (dans ton cas l'ADNc (pas ARNc, les vecteurs sont a ADN en majorité (sauf certains vecteurs viraux)) codant les recepteurs de ta cellule, sous le controle d'un promoteur fort, permettant une forte synthèse de l'ARNm correspondant) pour le gène d'intérêt ne comporte pas de gène de resistance à des antibio eucaryotes.  [...] Donc l'idée est de co transfecter les deux vecteurs, puis, dans les clones resistants (i.e. ayant intégré le vecteur de resistance), on va rechercher lesquels ont aussi intégré le vecteur contenant le cDNA. Dans ce cas, la probabilité d'intégration est encore plus faible (p²) (sur ce point je diffère de l'avis de fxmulder ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs intégratif+inductible

Oui je suis entrain de voir sa. Le pbi-EGFP m'a l'air d'être intéressant. Un vecteur retroviral serait le mieux, mais le plus souvent ils sont associés avec un un promoteur de type CMV trop fort, pour le moment j'ai pas trouvé de vecteur rétroviral inductible d'ailleurs je me demande même si sa existe.  [...] Enfête justement pour le moment je n'aie pas téstés ni la GFP ni le système inductible. Ce qui ne marche pas pour moi c'est un vecteur avec un promoteur non inductible et sans tag il contient un gène de resistance néo.  [...]

[biologie moléculaire] Numérotation d'un plasmide

Quant à la position du gène de résistance, il faut veiller à ce qu'il soit pas trop près de la MCS, suffisament loin du gène rapporteur s'il y en a un- pour éviter que le gène de résistance soit exprimé à partir du promoteur qui précède la MCS- et qu'il y ait un terminateur après pour que les transcrits du gène de résistance n'altèrent pas la réplication.  [...] s'agissant des gènes de résistance, il s'agit souvent du promoteur PGK ou SV40 pour les gènes mammifères. L'ampiciline possède son propre promoteur cloné avec l'ORF.  [...]

vecteur d'expression

Il existe des cellules qui ont été modifié pour les rendre permissive pour SV40(ex. HEK293T)... mais si tu veux exprimer ton gène il faut les transfecter avec un vecteur contenant un promoteur SV40.  [...] Le vecteur d'expression comprend la partie codant de ton gène, ainsi que des séquence non codante. promoteur, origine de réplication, polylinker... et souvent des gènes de résistances (ampiciline, neomycine...) ou des tag.  [...]

clonage insert

L'insert de 2825 pb est cloné dans un vecteur sous le contrôle d'un promoteur phagique Psp6. Après linéarisation du vecteur recombinant, celui ci est incubé en présence de l'ARN polymérase Psp6 et des 4XTP.  [...] Le vecteur recombinant est linéarisé puis incubé avec une ARNpol reconnaissant le promoteur Psp6 qui se trouve également sur ton vecteur et si tu met ça avec des DNTPs j'imagine qu'il se passe une reverse transcription.  [...]

[Biotechnologie] Composants d'un vecteur d'expression eucaryote

Ensuite, on a évidemment notre gène d'intérêt, son promoteur eucaryote, le signal de terminaison de la traduction, les sites de restriction (MCS) et le gène de sélection (auxotrophie le plus souvent ou résistance à un antibiotique). J'en suis à 7 (ou 6 si on compte les ORI pour 1).  [...] J'aurai mis un gène de sélection (un gène de résistance aux antibiotique ou un gène du métabolisme pr la levure) et un gène rapporteur, un promoteur, MCS (un site de clonage multiple). Tu peux mettre le + 1 avec la flèche juste après le promoteur.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

En fait, cela permettrait d'incorporer le gène d'intérêt ainsi que son promoteur et son terminateur au sein du vecteur.  [...] On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...]

[Biotechnologie] Que veut dire ... ?

on amplifie le fragment par PCR en ajoutant des séquences AgeI et NcoI dans les amorces, ce qui permet après digestion du produit de PCR (et du vecteur) par ces amorces de le cloner.  [...] grace a ces séquences de restriction, et sous l'actions d'enzymes de restrictions ou de ligases, tu pourras intégrer la sequence que tu as amplifié, à l'interieur d'un vecteur, ou au contraire l'en extraire.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur de clonage et le vecteur d'expression

Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel on va cloner le même fragment d'ADN après vérification du clonage dans le vecteur de clonage (taille de l'insert, séquence...) et grâce à son promoteur (constitutif ou inductible) ce vecteur va diriger la bactérie hôte d'expression pour produire la protéine d'intérêt.  [...] Vecteur d'expression. Destiné à transférer un gène et le faire exprimer dans une cellule hôte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription in-vitro

Je me demandais pourquoi, lors d'une transcription in-vitro, on doit obligatoirement linéariser le vecteur contenant l'ADN d'intérêt. Par exemple j'ai cloné mon ADN dans le vecteur pSFV1 pour le transcrire in-vitro je dois linéariser le vecteur à l'aide de l'enzyme Spe1 dont le site est situé juste avant le promoteur SP6 nécessaire à la transcription.  [...] Normalement on linéarise un plasmide pour pouvoir mettre un terme à la transcription in vitro. Si on ne linéarise pas, la polymérase transcrit et ne s'arrête pas. Je trouve ça étonnant de linéariser pour aider la polymérase à transcrire. Un vecteur de clonage est constitué de deux promoteurs, un qui sera en amont de notre gène (ADNc) et l'autre en aval.  [...]