• Forum - Vecteur, Produit, Digestion

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

As-tu fait migrer ton premier produit de PCR, celui qui t'a servi à faire le clonage est-ce qu'il est de 1500 ou 200 pb l'as-tu séquencé.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.  [...]

[Biotechnologie] Que veut dire ... ?

on amplifie le fragment par PCR en ajoutant des séquences AgeI et NcoI dans les amorces, ce qui permet après digestion du produit de PCR (et du vecteur) par ces amorces de le cloner.  [...] Seulement j'ai un peu de mal à comprendre une chose, comment des amorces peuvent digérer le produit de la PCR Puisqu'on intègre les séquences de AgeI et NcoI (et pas les enzymes elles-mêmes).  [...]

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction.  [...] [* ]Ligation reaction. réaction de ligation, C'est à dire que tu as dû utiliser une enzyme qui a collé les extrémités de ton vecteur à celui de ton produit de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'ADN

J'ai dans un premier temps fait une PCR de l'insert choisi en y ajoutant les sites BamHI. Cette PCR fonctionne car je récupère des bandes de la bonne taille (et les primers ont servi pour d'autres constructions...). J'ai ensuite purifié mon produit PCR et lancer une digestion.  [...] En parallèle, j'ai lancé la digestion de mon futur vecteur. J'ai purifié mes produits de digestion et lancé la déphosphorylation de mon vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

Cela fait un mois que j'essaie de réussir un clonage mais en vain. Je vois que le problème dont tu parles date du mois de novembre. As-tu trouvé une astuce Moi mon vecteur n'est pas aussi grand que le tien. 6kb, mon Insert fait 720pb. Les deux sont des produits de digestion NCOI et XHOI.  [...] Moi mon vecteur n'est pas aussi grand que le tien. 6kb, mon Insert fait 720pb. Les deux sont des produits de digestion NCOI et XHOI.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

En ce qui concerne pGEMT, il s'agit d'un vecteur pensé pour y cloner directement des produits PCR sans digestion de restriction ni ajout de sites.  [...] The pGEM®-T Vector Systems are convenient systems to clone PCR products. The pGEM®-T Vector is prepared by cutting the pGEM®-5Zf(+) Vector with EcoRV and adding a 3' terminal thymidine to both ends. These single 3'-T overhangs at the insertion site greatly improve the efficiency of ligation of a PCR product into the plasmid by preventing recircularization of the vector and providing a compatible overhang for ligation of PCR products generated by thermostable polymerases that add a single deoxyadenosine, in a template-independent fashion, to the 3'-ends of amplified fragments. (site promega).  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...] Votre approche est interessant mais pas applicable dans mon cas. L'intérêt de la k7 de resistance de 2000 pb est un témoin de digestion du phagemid. Dans votre stratégie, au lieu de purifié un produit de digestion, je puriferais sur gel un produit PCR. Je garde cela en tete mais je doute.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

As-tu plutôt digéré ton plasmide (DpnI avec plasmide) puis fais une étape de ligation pour lier ton produit de PCR au plasmide (avec une ligase).  [...] Je fais donc effectivement la digestion sur mon produit de PCR qui n'est autre que mon plasmide...(en théorie, si tout se passe bien).  [...]

[Biochimie] clonage

j'ai digéré mon vecteur et mes deux inserts en double digestion, ligation, transformation de la NM522 et...la première tentative j'en avait une 50aine de clones mais la PCR n'a révelé aucun clone positif mais pour toutes les autres tentatives je n'ai eu aucun clone que se soit sur le clonage proprement dit ( vecteur+ 2 inserts+ligase) que pour les deux autres controle (vecteur+ligase, vecteur seul).  [...] Ceci nous dit quand même quelque chose sous réserve que vous n'ayez pas dephosphorylé vos vecteurs (CIP). Comme le contrôle vecteur + ligase ne pousse pas, c'est que votre double digestion est effective. Du coup le problème se trouverait plutôt dans les inserts.  [...]