• Forum - Vecteur, Méthode, Dégradation

ubiquitine et protéasome

Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation.  [...] Si tu mets un bloqueur il n'y aura pas dégradation. Si tu vois une accumulation avec ton vecteur et sans ton vecteur (toujours avec un bloqueur) c'est que ton vecteur ne joue pas de rôle dans la dégradation. Si tu veux voir l'ubiquitination de la protéine alor sil faut bloquer le protéasome, et tu peux utiliser la technique classique de purif (mais qui est pas évidente du tout et demande un paquet d emise au point).  [...]

[Biologie Moléculaire] ligation

Ajouter un ddNTP aux extrémités avec une terminal transférase (je ne vois que cette activité enzymatique pour effectuer cette modification) conduirait à une impossibilité du vecteur à se recirculariser de façon irréversible. Il restera définitivement linéaire à moins d'ajouter une exonucléase peut-être, mais de toute façon je n'ai jamais entendu parler de l'utilisation de cette méthode pour empêcher un vecteur de se recirculariser, ni de son utilité.  [...] - Soit on clive le vecteur avec deux enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts collants incompatibles. L'insert est clivé avec les même enzymes. Cette méthode a l'avantage d'empêcher la recircularisation du vecteur et favoriser une insertion orientée de l'insert dans le vecteur.  [...]

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Comme sur un gel d'électrophorèse par exemple. J'ai pensé à ca mais je ne suis pas très sûre du résultat, je devrai visualiser juste une seule bande, sachant que la taille de mon gène est de ~880pb et le plasmide que j'utilise est de ~7900pb donc en principe j'aurai une bande de ~8700pb. Est¬ce une méthode correcte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Conclusion. On peut produire des protéines en DH5alpha grâce aux vecteurs pGEX. Cependant la dégradation induite par les protéases ne semble pas négligeable. Le represseur LacI q du vecteur n'eteint pas totalement l'expression du gène chimère. Peut être un problème à prendre en considération pour les protéines toxiques.  [...] C'est la methode qui est utilisee generalement pour les WB sur les etudes de stabilite proteique. Ca evite les degradations.  [...]

[Biotechnologie] An efficient TALEN mutagenesis system in rice

Pour produire des mutants KO (NDLT. inactivation d'un gène ou d'un locus), la transformation du cultivar de riz Nipponbare, par vecteur Agrobacterium, est pratiquée selon (la méthode ) Hiei et al.. Habituellement, 40 à 50 lignées transformées via TALEN d'appariement sont reproduits afin d'obtenir les mutants désirés.  [...] En gros la méthode de transformation par transfect bactérien chez les plantes est relativement plus efficace/rapide que d'autres méthodes. Utilisé sur des cellules végétales embryonnaires, le taux de mutation constaté dépasse les 30%.  [...]

[Génétique] vecteur de plasmide

dans les vecteur de plasmide en peut cloner un ADN étrange par insertion dans un gène de résistance à un antibiotique la question est quelle est la méthode pour identifier les bactéries qui ont incorporés les plasmides recombinés ou le plasmides intacte.  [...] Le test LacZ n'est qu'une méthode parmi d'autres pour savoir si le plasmide contient l'insert. Il faut garder l'esprit ouvert par rapport à cela car en laboratoire on n'insère pas systématiquement au milieu d'un site LacZ.  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

Bonjour. Je voudrais savoir quel est la méthode qui peut permettre de detecter l'insertion d'un vecteur en l'occurence moi c'est pour le vecteur pAC161. Je pensais à une PCR qu'en pensez vous.  [...] la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...]

[Biotechnologie] Méthode de fabrication d'un vecteur viral

Pour l'utiliser en thérapie genique, je veux savoir le matériel à utiliser pour la fabrication et la méthode ainsi.  [...] Ce qu'on veut dire, c'est que si vous pouvez avoir le matériel à disposition et savez vous en servir, c'est que vous savez comment créer ce vecteur et sinon, ce n'est pas sur un simple forum que vous pourrez apprendre tout ça.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression.

Décrivez les étapes (méthode de clonage, nature des amorces, condition d'hybridation, type de vecteur, gène rapporteur etc...) qui vous permettraient de préparer.  [...] Sachant que les extrémités ne peuvent pas être coupées par une enzyme de restriction, l'intégration du gène se fera par recombinaison.   [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

- sélectionner positivement sur streptomycine et négativement sur ampicilline (si j'ai bien compris, ton vecteur confère une résistance à la strept et si ton insert est là, les bactéries perdent leur résistance à l'ampicilline).  [...] De plus, tu devrais jetter tous les protocoles qui se respectent et qui pronnent un traitement systematique a la phosphatase. Bien souvent la dephosphorylation du vecteur engendre une degradation des extremites et des resultats par la suite vraiment tres etranges.  [...]