• Forum - Vecteur, Enzyme, CIP

[Biologie Moléculaire] Ligation Vecteur/insert après traitement CIP

j'ai une petite question de BM à vous poser car je bloque... voilà je fais actuellement du clonage dans mon labo, après digestion de mon insert et de mon vecteur avec une enzyme appropriée je CIP mon vecteur. J'aurai voulu savoir quel est le mécanisme de cette enzyme pour retire le 5'P et qu'il y ait un 3'OH à la place.  [...] Après, pour la ligation, je ne comprends pas comment elle peut avoir lieu entre l'insert et le vecteur si on a plus de 5'P au vecteur. La ligase utilise t'elle de l'ATP présent dans les buffer pour refaire des 5'P pour la ligature.  [...]

taille d'insert maximum à liguer dans un vecteur

J'ai cloné des tous petits inserts dans des gros vecteurs, et des gros inserts dans de petits vecteurs, il faut juste jouer un peu avec les ratios (par exemple liguer 50ng de vecteur avec 80ng pour un ratio 1/1, mais je conseillerai 1/10 et 1/20 juste pour voir) et peut etre avec l'enzyme CIP.  [...] merci à tous les 2, je vais essayer comme ça, bien que j'ai déjà utilisé l'enzyme CIP, que j'ai essayer en ratio 3 et 10 et je transforme mes bactéries par électroporation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

2)Pour le vecteur tu propose donc que je digère avec mes enzymes, que je traite à la phosphatase (pour éviter une religation je suppose), que je fasse une extraction au phénol, et qu'ensuite je me serve de cela (avec l'insert bien entendu) pour faire la ligation.  [...] La PO4ase alcaline d'intestin de veau (CIP) fonctionne très bien dans tous les tampons d'enzymes de restriction. Pour déphosphoryler un vecteur, j'ajoute une pouillette (0.5 ul sans me poser de question, c'est toujours un large excès) de PO4ase directement dans la réaction de digestion 1/2 heure avant la fin de ma réaction de digestion et je termine l'incubation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Le vecteur a été ouvert avec les mêmes enzymes. Les ligations se sont faites en respectant l'equimolarité c-a-d 1M de vecteur pour 3M d'insert.  [...] Et je ne m'inquiéterai pas trop d'avoir des concatémères, tu utilises 2 enzymes qui font des sticky ends qui ne sont pas compatibles alors il est très peu probable que tu es des 2 inserts ligués en même temps dans ton pET45b. Si tu veux en être certain la meilleure technique est de faire une control digestion avec une enzyme qui est au milieu de ton insert et une enzyme qui est dans ton vecteur (pas au milieu sinon ça ne sert à rien).  [...]

[Biochimie] clonage

j'ai digéré mon vecteur et mes deux inserts en double digestion, ligation, transformation de la NM522 et...la première tentative j'en avait une 50aine de clones mais la PCR n'a révelé aucun clone positif mais pour toutes les autres tentatives je n'ai eu aucun clone que se soit sur le clonage proprement dit ( vecteur+ 2 inserts+ligase) que pour les deux autres controle (vecteur+ligase, vecteur seul).  [...] EDIT. Ah, si même tes contrôles avec le vecteur vide ne révèlent rien, ça n'est pas ça. A tout hasard, tu as vérifié que ce n'est pas un petit comique qui a intervertit deux flacons d'enzymes de restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Je commence actuellement une construction pour generer un nouveau modele de souris transgenique. J'en suis seulement a la construction du vecteur et je me pose la question suivante. Je dois effectuer un clonage d'un fragment d'environ 700pb dans un plasmide au niveau d'un site EcoRI.  [...] Merci beaucoup. Et apparemment le traitement a la CIP de mon vecteur n'empechera pas la ligation evec l'insert de s'effectuer car il me semble que la ligase T4 peut liguer des terminaisons phosphorylees (celles de mon insert) aux terminaisons non phosphorylees (de mon vecteur).  [...]

[Biochimie] Transition G1/S

la cycline E est produite lors de la phase G1 (elle atteint son pic) et se fixe à son enzyme Cdk2,et à la fin de cette phase (G1) il y'aura blocage de la cycline E et début de synthèse des cycline de la phase S (cycline A).  [...] Le point R est contrôlé par la protéine Rb qui répresse le facteur de transcription E2F qui est un activateur de l'entrée dans le cycle cellulaire. Les CDK-Cyclines phosphorylent Rb qui dans un état hyperphosphorylé se détache d'E2F qui peut alors activer l'entrée dans le cycle cellulaire en stimulant l'expression de gènes impliqués dans les prochains évènements du cycle cellulaire (croissance, réplication de l'ADN, expression des cyclines suivantes,...).   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

Ca fait deux semaines que je tente de faire une ligation entre pCLNCX et mon insert. J'ai coupé mon plasmide par HindIII et amplifié mon insert avec des amorces contenant le même site de restriction HindIII, la taille de mon insert est bonne. celle de mon plasmide aussi, il a bien été digéré car j'ai comparé le plasmide digéré ou non.   [...] est- ce - que tu as procédé à une déphosphorylation de l'extrémité 5' de ton plasmide digérée l'utilisation d'une phosphatase alcaline est necéssaire dans l'étape qui précède la ligation puisque tu utilises un seul enzyme de restriction... car au moment de ligation il va être plus facile à un plasmide de se recirculariser plutôt qu'intégrer une autre séquence.  [...]

[Microbiologie] Recherche antibiotique pour bactérie

- lacIq que le répresseur lacI est exprimé de façon constitutive, ce qui permet d'induire l'expression du fragment du gène lacZ avec de l'IPTG pendant un clonage.   [...] - proAB. je pense que la souche est délété de certains gènes de l'anabolisme de la proline, mais que ces gènes sont fournis en trans sur un plasmide.   [...]

[Microbiologie] Hygiéne et sécurité

**nettoyage en place NEP ( cleaning in place CIP).  [...] Si vous ne faites aucun effort personne ne viendra vous aider. Et puis peut être n'y a t il aucun membre qui s'y connaisse en hygiène et sécurité.   [...]