• Forum - Vecteur, Contrôle, Transformation

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Donc effectivement, on peut avoir culture sur le contrôle puisque le vecteur est résistant à l'ampicilline (j'ai tendance à pas mal m'embrouiller avec tout ça). D'après ce que tu dis pour le contrôle négatif, un vecteur qui n'a pas inséré d'insert ne va pas entrer dans les bactéries lors de la transformation bactérienne et du choc thermique Le vecteur ne peut pas entrer seul dans les bactéries.  [...] La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert.  [...]

[Biologie Cellulaire] Stockage des bactéries thermocompétentes?

Après transformation de ces bactéries (avec mon vecteur et le vecteur de contrôle), je n'ai obtenu aucune colonie sur boite de pétri.  [...] C'est possible, la stabilité d'un plasmide est souvent lié à son utilisation par la bactérie, si celui ci n'apporte aucun avantage sélectif, celui ci sera délété (avantage sélectif, pas besoin de le dupliquer, de le transcrire/ traduire, etc.).   [...]

[Biochimie] clonage

j'ai digéré mon vecteur et mes deux inserts en double digestion, ligation, transformation de la NM522 et...la première tentative j'en avait une 50aine de clones mais la PCR n'a révelé aucun clone positif mais pour toutes les autres tentatives je n'ai eu aucun clone que se soit sur le clonage proprement dit ( vecteur+ 2 inserts+ligase) que pour les deux autres controle (vecteur+ligase, vecteur seul).  [...] Ceci nous dit quand même quelque chose sous réserve que vous n'ayez pas dephosphorylé vos vecteurs (CIP). Comme le contrôle vecteur + ligase ne pousse pas, c'est que votre double digestion est effective. Du coup le problème se trouverait plutôt dans les inserts.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant.  [...] oui, c'est donc le vecteur seul déphosphorylé qui sert de contrôle de transformation et non l'insert seul déphosphorylé comme tu le disais.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace. 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.  [...] le vecteur possede un gene de resistance a l'ampicilline et apporte donc la resistance à l'ampicilline quand il transforme une bactérie DH5a. Or si la bacterie est deja resistante a l'ampicilline avant la transformation, tu ne peux pas distinguer les bactéries transformées des bacteries non transformées resistantes à l'ampicilline.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

es-tu sûr que ta transformation s'est bien faite Qu'as-tu utilisé comme contrôle (contrôle d'activité de la ligase, contrôle de clivage effectif par les deux enzymes, contrôle de transformation).  [...] Ce que tu peux ensuite contrôler si tout ceci a fonctionné, c'est si EcoR1 clive bien le vecteur après l'action de BamH1 (ou l'inverse). clivage vecteur avec BamH1 puis ecoR1 (ou l'inverse) et ligation puis transformation. Normalement tu n'auras aucune colonie, mais je te conseille de faire un témoin clivage BamH1 + ligation + transformation, car le second clivage n'est pas forcément fiable à 100%, donc la présence de quelques colonies ne veut pas dire qu'EcoR1 derrière BamH1 est totalement inefficace.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

Pour commencer, je pense pas qu'il sagit de la ligase car a chaque ligation jeffectue un controle ligase. j'utilise le vecteur simplement digéré auquel j 'ajoute la ligase pour controler la qualité de la ligase car le plasmide simplement digéré se ferme facilement avec la ligase et si aprés transformation je trouve des colonie qui poussent sur le milieu additionné d antibiotique c'est que la ligase est OK et c'est mon cas.  [...] Par ailleurs j aimerais savoir si on peut controler le produit de ligation sur gel avant de transformer pour comprendre et pouvoir trancher entre probleme de ligation ou probleme de transformation et est ce que c'est normal qu'un clonage soit aussi dure à realiser ça fait qd mm 2 mois hihihi.  [...]

bactéries (reproduction)

TRANSFORMATION = transformation d'1 ADN étranger dans 1 bactérie par l'intermediare d'1 vecteur.  [...] Cette classification date de 1968 (N.E. Gibbons et R.G.E. Murray ). On l'utilise tellement en cours de licence (et probablement autant à al rentrée en maitrise ) que c'est devenu un automatisme.   [...]

Plasmides pour transformation de plantes

Je voudrais faire de la localisation de protéines dans des feuilles de tabac (transformation par bombardement, vecteur non binaire) et/ou en protoplastes d'Arabidopsis (transformation au PEG).  [...] ca ne devrait pas déranger, du moment que ce ne sont pas des plasmides mono ou di-copies les deux seront répliqués et envoyés pour transformer la plante.  [...]

Comment entre l'IPTG dans la bactérie ?

Peut être qu'après transformation avec un vecteur adéquat l'entrée de l'IPTG devient possible car le vecteur apporte avec lui un promoteur constitutif + le gène lac Y.  [...] On pourrait donc penser qu'il va rentrer dans la bactérie de la même manière que le galactose (transporteur membranaire, produit par l'opéron lac lui même).   [...]