• Forum - Vecteur, Bactérie, Expression, Protéine, Intérêt

[Biologie Moléculaire] Gros problème.....

je suis sensée créer un vecteur d'expression (Kit Qiagen pcDNA 3.1 TOPO isomerase) à partir de clones bactériens contenant notre protéine d'interet.  [...] J'ai ensuite réalisé une PCR avec le kit de ma Pfx (afin d'obtenir un insert à bouts francs pour pouvoir l'insérer dans mon vecteur d'expression), puis une gel d'agarose 1.5%.  [...]

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

Je sais qu'il est aisé de déterminer la structure primaire d'un protéine (et donc d'un anticorps) et de procéder à une reverse-translation d'une telle séquence d'acide aminés en une hypothétique séquence nucléique. Mais cela peut-il être juste ainsi.  [...] Ensuite, si tu as besoin de modifications post-traductionnelles (glycosylation, formation de ponts disulfure) tu peux mettre ce gène dans un plasmide d'expression eucaryotique, et faire de l'expression dans des cellules CHO, par exemple.  [...]

dégradation de protéine recombinante

Je rencontre actuellement un problème lors de l'expression et la purif d'une prot recombinante. j'utilise le vecteur d'esxpression pQE30 et je purifie sur colonne NI-NTA, mais voila lorsque que je charge le produit de ma purif sur gel SDS j'observe bien la protéine d'intérêt à la MM attendue mais également des bandes de MM plus basse.  [...] Ca devrait ameliorer pas mal les choses, je pense. Le PMSF, c'est une bonne chose, ça permet d'éliminer toutes les sérines-protéases (comme la trypsine). L'EDTA à la fin est important aussi, il élimine les métallo-protéases qui sont présentes en masse dans beaucoup de systèmes d'expression, notamment en bactéries il me semble.  [...]

[Biologie Cellulaire] Vecteur d’expression dans une bactérie

-Je voudrai savoir si lorsque l'on introduit un vecteur contenant l'adnc d'une protéine eucaryote dans une bactérie on est obligé de mettre une queux poly T sachant que les Arn procaryote non pas de queux poly A.  [...] Ce ne sont que des souvenirs de cours que je rapportais Ce que l'on nous a expliqué c'est qu'il semble y avoir un effet très lié entre les deux (et aussi entre le nombre de molécules de l'enzyme PMAB () qui ajoute les queues polyA et la dégradation. moins il y a d'enzyme, plus il y a de la dégradation), mais notre prof a parlé d' arguments très forts allant dans ce sens et pas de corrélation.   [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

Un possiblité en revanche est que tes protéines soient toxiques pour tes bactéries. Du coup seules celles qui expriment faiblement la produisent, les autres meurent. Dans ce cas le rendement est moisi. Une autre possibilité est que tes bactéries rejetent ta protéine dans des corps d'inclusions.  [...] 12 de DO c'est bien ce qu'il me semblait, parce que 1,2 au bout de 36h quand même... Et tu induis avec l'IPTG à cette DO Mais je ne comprends pas pourquoi tu veux atteindre des DO aussi élevées... Pour avoir plus de bactéries qui expriment ta protéine Est-ce que ça ne contribue pas plutôt à les faire crever plus vite.  [...]

Technique Gateway

J'ai vu la technique de clonage par Gateway, mais ce n'est pas clair du tout. Je ne vois pas l'intêret du passage d'un vecteur donneur, à un vecteur d'entrée, à un vecteur de destination et enfin d'expression.  [...] je n'étais pas sur d'avoir compris l'interet des 2 vecteurs et 2 recombinaisons pour cette technologie, je me demandais pourquoi ne pas utiliser directement le vecteur d'entrée comme vecteur d'expression.  [...]

vecteur d'expression

Je ne suis pas sur de comprendre. Le vecteur d'expression est le gène qui code pour la protéine recombinante ou bien c'est un fragment d'ADN qu'on ajoute en plus pour amorcer la transcription.  [...] Le vecteur d'expression est en général un plasmide circulaire contenant le gène d'intérêt accompagné de tous les éléments nécessaires à sa transcription, une ou plusieurs origines de réplication et un marqueur de sélection (gène de résistance ou autre).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation ADN plasmidique insert

et on l'a introduit dans une bactérie de souche E.Coli alors que dans tout les exercices fait en TD c'était des plasmides qui était modifié et intégré dans une bactérie.  [...] On s'en sert parfois comme vecteur vecteur d'expression chez Coli par fusions des gènes d'intérêt avec les protéines P8 et P3,  [...]

Protéine recombinante, promoteurs du vecteur d'expression

pour ce qui est de l'induction, il vaut mieux la faire juste avant la phase stationnaire car une fois passé ce cap, les bactéries s'isole de leur environnement en quelque sorte, en diminuant considérablement le nombre de pores membranaires. Donc la molécule inductrice ne peut plus traverser la membrane (peut-être que des molécules hydrophobes pourrait passer par diffusion passive.  [...] Pour ton gène bactérien, peut-être que c'est une séquence de type IRES, comme on les retrouve chez les eucaryotes, mais je ne sais pas si c'est valable pour les procaryotes... Il me semble mais je n'en suis pas sûr, je ne veux pas t'induire en erreur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Est-il possible que la protéine de fusion soit utilisée dans l'objectif de découvrir les fonctions de la forme soluble d'une protéine transmembranaire déja connue La protéine de fusion pourrait-elle mimer les fonctions de la protéine soluble initiale.  [...] Pour faire une protéine de fusion AB, il te suffit simplement de mettre la séquence codante de B juste à la suite de celle de A. Il faut juste enlever le codon stop à la fin de la séquence de A (sinon tu ne produiras que la protéine A). Tu vas alors obtenir un seul ARNm qui sera traduit en protéine AB.  [...]