• Forum - Tube, Référence, ARNm, ATP

[Biologie Cellulaire] Traduction in vitro

Une expérience a été faite ou dans le tube référence en mets ARNm + ribosomes + ARNt + AA + ATP.  [...] Les protéases vont dégrader toutes les protéines non synthétisée (l'hémoglobine entre autre), mais aussi ton ribosome malheureusement. Par contre ta protéine synthétisée sera protégée dans les microsomes et donc tu l'as récupereras presque pure.   [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN

j'ai testé plusieurs protocole d'extraction d'ARN (kit RNeasy, Chang et Al 1993, Reid et Al 2006) mais je n'obtiens pas un grand rendement (200ng/uL et en faisant 8 répliquat par échantillons j'obtiens au mieux 10ug...) Il m'en faudrais bien plus car après je dois synthétiser des cDNA et là il me faut 100 ng minimum d'ARNm.  [...] Au début du protocole de chang et Al, on doit incuber 10-15 min à 65°C, peut etre faut -il incuber plus longtemps, 30-45min (je reste sur ce protocole car kit presque épuisé, et protocole de la vigne= Reid et Al =contamination ADN avec un traitement à la DNAse...).   [...]

Traitements des données en QPCR

Dans une première manip, je vais faire deux courbes standart (une pour le gène de référence et une pour le gène d'intérêt) et je vais mettre tous mes échantillons (ADN immunoprécipité, plus le tube sans anticorps ) avec chacun des deux couples de primers.  [...] Quelqu'un dans mon labo m'a dit de comparer les valeurs quantité d'ADN immunoprécipité sur quantité d'ADN non spécifique dans le tube sans anticorps (Ac/sans Ac) et de calculer des barres d'erreur là dessus. Par contre, cette personne ne normalisait pas par rapport au gène de référence.  [...]

[Biologie Cellulaire] Test d'activité des kinases

Donc un essai kinase permet une évaluation plus directe d'une phosphorylation, à condition d'avoir une version Wt et une version mutante inphosphorylable sur le site que tu recherches et/ou que tu veux étudier. C'est assez simple comme expérience. Dans un même tube tu met ta protéine, de l'ATP froid et de l'ATP radiomarqué au 32P, et la kinase phosphorylant ton site d'intérêt.  [...] Les differents controles peuvent etre l'utilisation d'inhibiteurs s'il en existe mais aussi l'asbence de kinase par exemple.   [...]

[Biologie Moléculaire] Que devient l'ARNr dans une reaction de RT

Effectivement, je n'ai pas utilisé de RNAse, ma transcriptase reverse a une petite activité RNase H (élimine les ARN des Hybrides ARN.ADN), j'utilise des oligo DT pour que ma RT soit spécifique des ARNm...alors dans mon tube de RT j'ai de l'ARN total, donc quand je depose moin cDNA sur puce, j'ai de L'ARNt, l'ARNr l'ARNm et du cDNA...alors ou sont passés mes ARNr.  [...] 1/ concernant l'échelle. effectivement j'ai une échelle différente sur mes graphes. pour l'ARN je vais jusqu'à 30 fu (unité de fluorescence) pour mes cDNA à 3 mais si je vois mon ARNr à 30 Fu je devrais le voir d'avantage à 3 Fu sauf si il a été dégradé, étant donné que pour une efficacité de 100% de ma RT, 1 brin d'ARNm est transformé en ADNc, je devrais avoir dans tous les cas, toujours moins d'ADNc que d'ARNr (80% environ des ARN).  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique d'hybridation

Je pense qu'il pourrait s'agir de la transcription inverse cependant un détail m'intrigue. l'hybridation de la sonde d'ADN monocaténaire sur des ARNm séparés par électrophorèse. La transcription inverse s'effectue dans un tube sans que les ARN aient été séparés auparavant.  [...] Si les ARNm sont d'abord séparés par éléctrophorèse et qu'on utilise une sonde ADN marqués monocaténaire, il s'agit alors d'un northern blot qui permet de détecter un ARNm parmi les autres sans réaction de transcription inverse derrière. Northern blot et transcription inverse ne se réalise jamais en même temps.  [...]

[Biochimie] dosage des proteines

elisa. 1_sensibilisation des microplaque avec l'antigene,incubation une nuit a 4°c,2_lavage de l'excés non fixé au PBS...3_inoculation de l'anticorp(AC) a detecté,incubation a 37°c pendant 10mn...,4_lavage de l'excés non fixé,5_ajout de PBS 5% de lait ecremé pour saturer tout les sites libre.   [...] bradford. 1_solution de proteine reference BSA dans des tubes a concentration ascendante,volumes finaux egaux ajuster avec du NaCl, 2_solution de la proteine a doser (x) dilué, 3_ reactif de bradford que l'on ajoute dans les tube,meme dans le banc (qui ne contien rien),..courbe detalonage.  [...]

[Physiologie] Rénal: urée

Et je pense que pour la résorption partielle de l'urée au niveau de l'extrémité du tube collecteur ne nécessite pas d'ATP parce qu'elle ce fait à l'aide de l'ADH (hormone antidiurétique, qui participe au maintien du gradient corticopapillaire et par conséquent à la gestion de l'eau).  [...] Les diverses activités exercé par l'ADH s'exercent par l'intermédiaire de récepteur différent, comme par exemple au niveau du tubule rénal sont localisés des récepteurs V1 (voie de l'AMPc), les autres fonctions sont médiées par des récepteurs V2 (voie de l'IP3).   [...]

RT-PCR et PAGE en conditions dénaturantes???

l'avantage d'une PCR en temps réelle par rapport à une RT-PCR classique est qu'elle va permettre de dire si il y a 2 fois plus. 2,4 fois plus. 13, 8 fois plus d'ARNm dans une conditions par rapport à une autre. quantification relative impossible à faire en RT-PCR (qui te permet de dire.  [...] si pendant ta PCR en temps réelle, tu insère un standard au sein de la manip, tu vas pouvoir être capable de dire le nombre de copies de ton ARNm présent dans le tube. tu arrives à de la quantification abslue, et là, on rentre dans le domaine de la Q-PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] structure des protéines

* ne t'embrouille pas. dans le corps (humain, allez ), l'insuline est sécrétée au niveau du pancréas. Mais ici Tu fais quelque chose sur ta paillasse, in vitro, nulle part on te parle d'excrétion... Donc, on extrait des ARNm du gène codant l'insuline, on les met dans un tube à essaie contenant du milieu acellulaire et on espère que ça marche.  [...] Le témoin est la molécule/l'organisme que l'on prend pour référence. C'est en comparant avec lui que l'on pourra dire quoi que ce soit par rapport à ce que l'on voit.  [...]