• Forum - Transformation, Vecteur, Extraction

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

contrôle-qualité de l'ADN recombinant. transformation dans E. coli, sélection des clones recombinants et extraction du vecteur d'expression.  [...] Ensuite, une fois que tu as tout ça, tu transformes pour voir des phénotypes associés à des mutations, des sauvetages de phénotypes ou ce que tu cherches De toute façon, tu conserveras ton ADN en tube après son extraction, pas dans des cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clone sans ADN

Ensuite, je fais une ligation, soit overnight à 16 degré ou encore 1 heure a température de la pièce. Puis, je fais une transformation (version longue). J'ai des clones sur mes géloses ainsi qu'un bon ratio par rapport à mes géloses contrôles, tout ce qui a de plus simple jusque là.  [...] Vous avez fais une transformation des mêmes cellules avec un autre vecteur Vous avez réussi à le récupérer avec le même protocole d'extraction et les mêmes solutions.  [...]

L'extraction d'ADN génomique et transformation de levure

Bonsoir, je suis en master pro et je recherche le rôle de certain tampons présents lors de l'extraction d'ADN génomque et lors de la transformation de S.cerevisiae.  [...] Alors j'ai du PEG (complexant des molécules H2O je crois) Mais je vois pas trop à quoi ça sert dans la transformation de cellules, de l'acétate de lithium (pour créer des pores) et de l'ADN de sperle de Hrang dénaturé (là je vois pas...) tout ça c'est pour le protocole de trasnfo.  [...]

bactéries (reproduction)

TRANSFORMATION = transformation d'1 ADN étranger dans 1 bactérie par l'intermediare d'1 vecteur.  [...] Les bactéries capables de conjugaison possèdent des gènes spécifiques, codant par exemple pour la piline (protéine constituant le pilus) ou encore la SPase III (jouant un rôle dans la production de la piline). Je n'ai pas connaissance de Firmicutes ou Tenericutes capables de conjugaison, que pour les Gracilicutes (à confirmer).   [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Donc effectivement, on peut avoir culture sur le contrôle puisque le vecteur est résistant à l'ampicilline (j'ai tendance à pas mal m'embrouiller avec tout ça). D'après ce que tu dis pour le contrôle négatif, un vecteur qui n'a pas inséré d'insert ne va pas entrer dans les bactéries lors de la transformation bactérienne et du choc thermique Le vecteur ne peut pas entrer seul dans les bactéries.  [...] En ce qui concerne l'efficacité de ta transformation (vecteur+insert) elle n'est que de 13.10^3 bactéries transformées/µg d'ADN ce qui est faible (une valeur de 10^6 est en général souhaitable).  [...]

[Biologie Cellulaire] Stockage des bactéries thermocompétentes?

Après transformation de ces bactéries (avec mon vecteur et le vecteur de contrôle), je n'ai obtenu aucune colonie sur boite de pétri.  [...] C'est possible, la stabilité d'un plasmide est souvent lié à son utilisation par la bactérie, si celui ci n'apporte aucun avantage sélectif, celui ci sera délété (avantage sélectif, pas besoin de le dupliquer, de le transcrire/ traduire, etc.).   [...]

Plasmides pour transformation de plantes

Je voudrais faire de la localisation de protéines dans des feuilles de tabac (transformation par bombardement, vecteur non binaire) et/ou en protoplastes d'Arabidopsis (transformation au PEG).  [...] Je vais donc faire des doubles transformations. un plasmide contenant mon gène d'intérêt fusionné à la GFP et un plasmide ayant une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la RFP me servant de marqueur mitochondrial.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

Ensuite tu clives le vecteur avec BamH1 (ou EcoR1), et tu réalises ta ligation, sans l'insert, puis tu transformes avec le vecteur vide (qui n'a subit aucune étape de modification) et en parallèle avec le vecteur religué. Là tu verras d'une part si la transformation marche (avec vecteur vide) et si la ligase marche (vecteur clivé religué).  [...] Ce que tu peux ensuite contrôler si tout ceci a fonctionné, c'est si EcoR1 clive bien le vecteur après l'action de BamH1 (ou l'inverse). clivage vecteur avec BamH1 puis ecoR1 (ou l'inverse) et ligation puis transformation. Normalement tu n'auras aucune colonie, mais je te conseille de faire un témoin clivage BamH1 + ligation + transformation, car le second clivage n'est pas forcément fiable à 100%, donc la présence de quelques colonies ne veut pas dire qu'EcoR1 derrière BamH1 est totalement inefficace.  [...]

Comment entre l'IPTG dans la bactérie ?

Peut être qu'après transformation avec un vecteur adéquat l'entrée de l'IPTG devient possible car le vecteur apporte avec lui un promoteur constitutif + le gène lac Y.  [...] On pourrait donc penser qu'il va rentrer dans la bactérie de la même manière que le galactose (transporteur membranaire, produit par l'opéron lac lui même).   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).  [...] le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel). 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).  [...]