• Forum - Transformation, Contrôle, Colonies, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

La premiere est de verifier que tes cellules sont competantes (transformation d'un plasmide circulaire connus ~ 50 ng, genre pUC, pBR, etc).  [...] 1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] La seule chose que je peux te dire c'est que la manip de transformation des bactéries par le vecteur seul a raté, et qu'un très faible nombre de colonies a donc pu se développer. Par curiosité, combien de colonies par µg d'ADN as tu obtenu dans le contrôle et dans la transformation avec vecteur + insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

Fais tu une transformation contrôle avec l'insert seul déphosphoré + ligase Y a-t-il autant de colonies que dans plasmide + insert.  [...] Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant.  [...]

utilisation des résistances aux antibiotiques

au cours de la transformation bactérienne ( E.coli avec un plasmide ) quelle est l'origine des colonies apparues sur milieu sélectif.  [...] Et pour compléter la question initiale, il existe des alternatives aux gènes de résistances aux antibiotiques sur les vecteurs, comme l'utilisation de systèmes poison-antidote (toxine-antitoxine) qui permet la croissance uniquement des bactéries transformés avec un plasmide ayant incorporé l'insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

en vu de clonner un fragment de gene, jai commencé par préparer des cellules compétentes DH5a, par traitement avec la glace. 20min dans la glace suivies par des lavages avec le glycerol. Aprés la transformation par électroporation, j'ai trouvé des colonies sur la boite LB+Amp de controle négatif( cellules DH5a sans vecteur) sur les autres boites LB+ Amp+ IPTG+ X-Gal j'ai trouver des colonies blanches et des colonies bleu.  [...] Le fait d'avoir des colonies sur ta boite controle indique que soit tu t'es trompé et tu as mis du plasmide la ou il ne fallait pas. soit que tu as une legere contamination (ca depend aussi du nombre de colonies que tu as).  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

1/ Calcule to efficacité de transformation, si elle est en dessous de 10^6 colonies /ug de pUC18 (ou un plasmide de petite taille équivalent), jette tes bactéries et reprépares-en d'autres (ou achètes-en d'autres). Je vois trop d'étudiants me dire j'ai transformé 1ug de plasmide et j'ai un tapis, donc mes bactos sont OK.  [...] Des bactéries à 10^4 colonies/ug donneraient aussi un tapis avec 1ug de plasmide, pourtant elles seraient impropre à la plupart des constructions.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

Déjà une chose, ça a pris plus de temps que d'habitude pour avoir des colonies. Le contrôle positif fait avec un de mes vecteurs et les cellules a donné des colonies après une nuit (normal). Pour mes plaques de transformation, j'ai du attendre 1 jour pour avoir des coloniees bien visibles.  [...] Ce qui me semble étrange, c'est que si l'ampicilline était vraiment inactif, j'aurai du obtenir beaucoup plus de colonies sur mes plaques de contrôles et de transformation (en moyenne 40 colonies obtenues). Mais j'ai vraiment du mal à comprendre comment c'est possible d'avoir les colonies blanches et de n'avoir aucun ADN plasmidique sur le gel ensuite.  [...]

transformation de bactéries

Je suis actuellement en stage en Angleterre, je travaille sur les telomeres et j'ai un probleme dans une manipulation pourtant basique.   [...] Je dois inserer dans un plasmide de 7.3kb (pGBKT7) une insert de 1926bp, le probleme est qu'apres ma transformation de bacteries (cellules competentes de E.Coli), je n'obtiens absolument aucunes colonies.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

T1 est un contrôle qui permet de voir combien tu obtiens de clones avec ta simple digestion de plasmides. Si tu as des colonies c'est que tu as encore des plasmides qui n'ont pas été digérés pendant cette étape.  [...] Donc pour moi T1 est un témoin pour montrer le nombre de colonies ayant intégré un plasmide.. Témoin de transformation c'est ça.  [...]

[Biologie Moléculaire] Faux positif en mutagénèse dirigé

Je réalise une mutagènese sur un plasmide plenti afin de modifié 3 bases qui ont 1 à 2 bases d'écart en 1 mutagénèse. Après transformation j'ai plein de colonies. Problème en les séquençant mes mutations n'ont pas disparu.  [...] Ce qui implique que ta digestion a la dpnI n'a pas été assez efficace. As tu fait ton controle sans mutagenese pour vérifier cela.  [...]