• Forum - Transformation, Choc, Thermique

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).  [...] le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel). 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème avec mes transformations

J'ai un protocole pour la transformation pour rendre les cellules compétentes par chlorure de calcium puis effectuer le choc thermique.  [...] Si vous avez l'habitude de faire des transformations par choc thermique, quelle volume du produit de ligation mettez-vous en général pour que ça fonctionne bien.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

Le protocole est assez classique. transformation de bactéries avec 5ng de plasmide par choc thermique et sélection sur pétrie avec d'ampicilline.  [...] Edit. bien sur il faut refaire une transformation, l'efficacité de la production diminuant en général avec le temps depuis la transfo. Je n'utilise jamais pour la production de transfo vieilles de plus de 3 jours.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de clonage dans le pGEM-T easy vector.

Ce qui me semble étrange, c'est que si l'ampicilline était vraiment inactif, j'aurai du obtenir beaucoup plus de colonies sur mes plaques de contrôles et de transformation (en moyenne 40 colonies obtenues). Mais j'ai vraiment du mal à comprendre comment c'est possible d'avoir les colonies blanches et de n'avoir aucun ADN plasmidique sur le gel ensuite.  [...] Par contre, par choc thermique, ce ne serait pas idéal dans ce projet. Et je sais que ça a déjà fonctionné avec le pGEM-T pour d'autres avec un insert de la même taille avec l'électroporation.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

J'ai refais hd la ligation en diluant un peu plus le milieu reactionnel et en augmentant un peu la quantité de ligase et j 'ai suivi le conseil de celyena en incubant dans un bain marie au lieu d'in thermocycleur et demain je ferais la transformation dans deux souches. top 10 et JM109.  [...] Mon clonage ne marche tjs pas, pour la transformation est ce le choc thermique à 42°C pendant 2 minutes peut inhiber la transformation ou bien cela na pas vraiment d importance.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment.  [...] Le problème est probablement résolu depuis belle lurette, mais si quelqu'un est dans le même cas de figure, j'apporte tout de même mon grain de sel. Je pense que le problème est bel et bien que la transformation n'est pas fait dans la bonne bactérie. En effet, les plasmides issus de cette mutagénèse ne sont pas fermés, ils doivent donc être transformés dans des XL1 qui a la capacité de lier les deux bouts du plasmide.  [...]

je suis en mode panique pour mon rapport(transfo levure)

Bonjour tous le monde, je en BTS anabiotech, et la j'aurai besoin que quelqu un m explique clairement le principe de la transformation des levures par choc thermique avec le PEG et le acétate de lithium (en vue de réalisé un double hybride).  [...] L'introduction des vecteurs recombinants dans la levure Saccharomyces cerevisiae Y190 se fait transformation au PEG.  [...]

transformation levures

J'ai une petite question, j'a réalisé une transformation de levures avec la méthode du LiAc. A la fin il faut réaliser une choc thermique en passant les tubes 30 min à 30°C puis à nouveau 30 min à 42°C. Seulement ayant eu la tête en l'air j'ai d'abord mis mes tubes une demi-heure à 42°C.  [...] Sinon je dirais comme Yoyo, la transformations de levures par LiAC n'est pas compliquée et donne un bon rendement si tu tiens compte des conseils de Yoyo.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transformation au CaCl2

Bonjour, j'ai deux petites questions a propos de deux étapes de la transformation cellulaire au CaCl2. 1- Quel est l'utilité du choc thermique après l'ajout du CaCl2 Moi je crois que cette étape sert a insérer le vecteur dans la cellule. 2- pourquoi préchauffer le milieu SOC avant étalement sur gélose Quel sont les avantages et les composantes au milieux SOC Merci.  [...] - Transfection. les méthodes utilisant des agents polycationiques (DEAE-Dextran, PEI (PolyEthylenImine), polylysine), des liposomes cationiques.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Lebacteries utilisés sont competente,mais pour des raisons diverses,hier on a effectué des culture sur TOP 10 avec transformation par choc thermique et ce matin,on a eu que des colonies bleues,les bacteries ne semblent pas avoir survecues et les seules survivantes n'ont pas integrer l'insert.  [...] Sinon, quelles sont les proportions respectives insert. vecteur pour la ligation Quel volume de ta ligation utilises-tu pour quel volume de cellules compétentes lors de la transformation Es-tu sûr de bien ajouter le 1 mL de LB tout de suite après le choc électrique.  [...]