• Forum - Transformation, Cellules, Compétentes, Choc, Thermique

[Biologie Moléculaire] Problème avec mes transformations

J'ai un protocole pour la transformation pour rendre les cellules compétentes par chlorure de calcium puis effectuer le choc thermique.  [...] Dans ce protocole on utilise 200 ul de cellules compétentes + 20 ul du produit de la ligation et comme autre transformation avec 60 ul du produit de la ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).  [...] le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel). 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

A ne pas négliger, le fait que tu es choisi d'autres bactéries que celle du kit. Sont-elles compétentes pour une transformation par choc thermique Est-ce les mêmes que celles utilisées pour les clonages qui ont fonctionné précédemment.  [...] Le problème est probablement résolu depuis belle lurette, mais si quelqu'un est dans le même cas de figure, j'apporte tout de même mon grain de sel. Je pense que le problème est bel et bien que la transformation n'est pas fait dans la bonne bactérie. En effet, les plasmides issus de cette mutagénèse ne sont pas fermés, ils doivent donc être transformés dans des XL1 qui a la capacité de lier les deux bouts du plasmide.  [...]

Expériences en génétique…

Oui alors là je crois qu'il y a effectivement quelques confusions. Si tu veux transformer une bactos rendu compétente (par du Ca2+ et non pas par du Na+), tu as plusieurs possibilités dont le choc thermique (celle que j'utilise habituellement) qui consite en un passage d'environ 45 secondes à 42°C, ou également la lipofection, l'électroporation, etc.  [...] En biologie moléculaire, on utilise ces plasmides pour intégrer des morceaux d'ADN dans des bactéries rendues compétentes, c'est-à-dire perméables, l'ADN rentre tout seul dedans grâce à un choc électrique ou un choc thermique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Lebacteries utilisés sont competente,mais pour des raisons diverses,hier on a effectué des culture sur TOP 10 avec transformation par choc thermique et ce matin,on a eu que des colonies bleues,les bacteries ne semblent pas avoir survecues et les seules survivantes n'ont pas integrer l'insert.  [...] Sinon, quelles sont les proportions respectives insert. vecteur pour la ligation Quel volume de ta ligation utilises-tu pour quel volume de cellules compétentes lors de la transformation Es-tu sûr de bien ajouter le 1 mL de LB tout de suite après le choc électrique.  [...]

[Identification] Comment isoler des bactéries non cultivables ?

Je souhaiterais savoir comment isoler et étudier des bactéries non cultivables d'un échantillon de sol. J'ai entendu parler de l'hybridation in situ en fluorescence mais cela nécessite une connaissance préalable de la bactérie recherchée. Ce que je voudrais c'est obtenir une bonne méthodologie pour étudier l'ensemble des bactéries non cultivable d'un échantillon de sol. Merci.   [...] En un premier temps je souhaite connaître quelles sont les espèces présentent dans dans la rhysospère. J'ai déjà identifié certaines espèces cultivables sur base de leur profil ITS et de leur gène 16S. L'approche qui me semble la plus simple est de réaliser une amplification ITS sur l'ADN total de la rhyzosphère et de voir si je retrouve des profils ITS différents de ceux que j'ai déjà identifié.   [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

Comment les bactéries sont-elle rendues compétentes Par quelle technique Et qu'est-ce que la transformation précisément.  [...] Sans ADN Tu veux dire que ce sont des cellules compétentes non transformées avec le plasmide recombinant Il vaut mieux que tu écrives d'une manière plus claire et précise.  [...]

transformation de bactéries

Je suis actuellement en stage en Angleterre, je travaille sur les telomeres et j'ai un probleme dans une manipulation pourtant basique.   [...] Je dois inserer dans un plasmide de 7.3kb (pGBKT7) une insert de 1926bp, le probleme est qu'apres ma transformation de bacteries (cellules competentes de E.Coli), je n'obtiens absolument aucunes colonies.  [...]

Plasmide

dans mon rapport, il est indiqué que après la ligature, je fais une transformation des cellules d'E.colis compétentes et une fois les cellules transformés je lai extrait avec le kit wizard Plus SV.  [...] La selection des plasmides recircularisés se fait lors de la transformation de cellules électrocompétentes. Seules les cellules ayant reçu un plasmide recircularisé pourront croitre sur le milieu sélectif car seulement ces plasmides peuvent coder pour le gène de résistance en question (la sélection doit se faire sur Ampicilline je suppose ).  [...]

[Microbiologie] Quelle souche d'E.coli pour préparer des cellules compétentes?

J'aurais besoin de rendre des cellules E.coli compétentes pour faire une transformation de plasmide mais je n'ai dans mes stock que la souche ATCC Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers (n° 8739).  [...] Encore mieux, la préparation de cellules compétentes avec du chlorure de rubidium en plus (cellules au moins 10x plus compétentes qu'avec le CaCl 2 ).  [...]