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western blot

D'où déjà, nous avons pense au fait que le transfert total des protéines par semi-dry n'a pas eu lieu. Or nous avons observe le transfert partiel du marqueur. De ce fait nous avons utilise le gel transféré et avons refait le transfert par semi-dry et nous observons un transfert total.  [...] J'aimerais savoir comment faire pour transférer toutes mes protéines par semi- dry Est ce que le colorant (simple blue) a un effet sur le transfert total des protéines pour un semi-dry.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Avant de s'attaquer au transfert, êtes-vous sûr, dans un premier temps, que les protéines de cette taille rentrent dans le gel dans vos conditions de migration.  [...] Personnellement, j'ai transféré efficacement une protéine de 350 kDa mais ça marche uniquement avec les systèmes de transfert à sec. La bande de marqueur à 250 kDa était elle seulement partiellement transférée dans les systèmes liquides et totalement dans les systèmes à sec.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

2) Je souhaite transférer une protéine de 210 kDa sur membrane PVDF. J'ai fait un transfert à 70V sur 90 min mais les hauts poids moléculaires n'ont pas bien transféré (il restait un peu d'échelle dans mon gel). Quelqu'un a une idée des meilleurs conditions de tranfert pour ce type de protéines J'ai entendu parler de transfert overnight à 4°C 12V.  [...] J'utilise le kit RNeasy Mini. Il est prévu pour extraire les ARNs à la base mais on peut aussi récupérer les protéines dans le tampon RTL. Il suffit juste de faire une précipitation à l'acétone.  [...]

[Biochimie] Western blot en pointillés

Certaines protéines sont capricieuses lors du transfert. Tu utilises du PVDF, tu transfères en méthanol sans SDS Tu fais 30V combien de temps.  [...] Avant je faisais un transfert identique à toi au niveau chimique (PVDF, méthanol sans SDS), 1 heure 30 à 400mA constant. J'avais les protéines de haut poids moléculaire qui se transférait mal vu avec les marqueurs de taille + PARP non clivé (110 kDa). Du coup je suis passé au même transfert mais d'une durée de 2h15-2h30.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

Colorer le gel après le transfert histoire de voir si il y a encore les protéines dessus (et si il n'y en a plus prier pour qu'elles soient sur ta membrane). C'est pas la meilleur chose à faire.  [...] La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Moi je serai toi je transfererai longtemps (quite à mettre deux membranes supperposées si tu veux aussi voir des protéines plus petites qui risques de passer à travers la première). Et j'utiliserai éventuellement une membrane avec une taille de pores plus importante (que le 0,2µ classique).  [...] Perso j'utilise un marqueur de PM colore ca aide en rien le transfert, mais comme ca tu sais immediatement si les proteines de haut PM ont ete transfere ou pas (pas besoin de se faire un western dans le vide).  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème de O glycosylation

C'est a l'interieur des saccules que se trouvent les enzymes nécessaires, et non pas dans le cytosol, donc les seuls parties des protéines membranaires accessibles sont celles dans les vésicules pas les parties cytosoliques ou il n'y a pas les enzymes nécessaires.  [...] ducoup puisqu'elle s'arrete et reste ancrée dans la membrane avant transfert total, le signal de Oglyco étant proche de l'extrémité N-ter n'est pas rentré dans le RE.  [...]

[Biochimie] Diverse question

c'est pas clair. A partir de quoi la masse molaire de la protéine totale peut être que la réponse attendue est un western blot en condition natives.  [...] cela permet de connaitre la masse théorique de chacune des protéines de l'hétérodimère, cela se termine ensuite par une addition.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot

La nitrocellulose et le PVDF ont des propriétés chimiques leur permettant de fixer avec une haute affinité la plupart des protéines (pour ne pas dire toutes). On peut en quelque sorte les assimiler à une plaque adhésive à protéines. Lors du transfert, les protéines vont du gel vers la membrane et sont alors scotchées à la membrane.  [...] La membrane ne peut plus coller de protéines aux endroits où des protéines s'y sont déjà fixées. Il reste cependant une surface importante encore adhésive où l'anticorps, qui est une protéine, se fixera. Pour l'empêcher on incube donc la membrane en présence de protéines, ainsi elle ne pourra plus scotcher l'anticorps, ce sera en quelque sorte comme si du ruban adhésif avait été souillé par de la poussière.  [...]

Help: rôle des protéines!

le transport (transport d'O2 par l'hémoglobine, transport de part et d'autre des membranes cellulaires via des protéines canal...).  [...] le transfert d'information. transduction des messages hormonaux grâce à des protéines récepteurs situées dans les membranes cellulaires.  [...]