• Forum - Transfert, Protéines, Membrane

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

Colorer le gel après le transfert histoire de voir si il y a encore les protéines dessus (et si il n'y en a plus prier pour qu'elles soient sur ta membrane). C'est pas la meilleur chose à faire.  [...] La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot

La nitrocellulose et le PVDF ont des propriétés chimiques leur permettant de fixer avec une haute affinité la plupart des protéines (pour ne pas dire toutes). On peut en quelque sorte les assimiler à une plaque adhésive à protéines. Lors du transfert, les protéines vont du gel vers la membrane et sont alors scotchées à la membrane.  [...] La membrane ne peut plus coller de protéines aux endroits où des protéines s'y sont déjà fixées. Il reste cependant une surface importante encore adhésive où l'anticorps, qui est une protéine, se fixera. Pour l'empêcher on incube donc la membrane en présence de protéines, ainsi elle ne pourra plus scotcher l'anticorps, ce sera en quelque sorte comme si du ruban adhésif avait été souillé par de la poussière.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot avec membrane PVDF

Je transférais mes protéines sur une membrane de nitrocellulose (transfert semi-sec avec Trans Blot Turbo System de Bio-rad) mais j'ai testé depuis peu la membrane de PVDF (même méthode de transfert). J'ai incubé mes membranes avec plusieurs anticorps primaires (toujours les même anticorps et 1 anticorps primaire/membrane).  [...] Cependant après révélation, je retrouve sur toutes mes membranes le même genre de motifs, des bandes très épaisses entre 60 et 80 kDa par exemple. A cause de ça je n'arrive pas a détecter la présence de mes protéines d'intérêt, les bandes étant noyées dans les plus épaisses.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Moi je serai toi je transfererai longtemps (quite à mettre deux membranes supperposées si tu veux aussi voir des protéines plus petites qui risques de passer à travers la première). Et j'utiliserai éventuellement une membrane avec une taille de pores plus importante (que le 0,2µ classique).  [...] Perso j'utilise un marqueur de PM colore ca aide en rien le transfert, mais comme ca tu sais immediatement si les proteines de haut PM ont ete transfere ou pas (pas besoin de se faire un western dans le vide).  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...]

[Biochimie] Questions Coomassie et Western Blot

Le méthanol et l'éthanol rendent le gel plus poreux, ce qui permet de faciliter les échanges avec le tampon (que ce soit de transfert ou de staining en coomassie). Cela permet une meilleure pénétration du coomassie dans le gel pour colorer les protéines, et cela facilite la sortie des protéines du gel pour le transfert.  [...] Pour le transfert, les solvants ont un intérêt beaucoup plus forts car ils permettent la dissociation du SDS des protéines, ce qui permet aux protéines d'interagir avec la membrane de PVDF par interactions hydrophobes et électrostatiques, mais pas ioniques comme l'exigerait une interaction avec le SDS.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

En fait ce que je voulais savoir c'est s'il est possible de faire migrer sur gel une proteine couplée à la peroxydase puis de la transferer sur membrane et cela en condition non dénaturante pour que la peroxydase après avoir été blottée puisse encore réagir.  [...] Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Je te conseille de transférer sur des membranes de PVDF préalablement mouillée dans du méthanol. La capacité de charge en protèïnes est plus importante (le double de la nitrocellulose).  [...] Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

2) Je souhaite transférer une protéine de 210 kDa sur membrane PVDF. J'ai fait un transfert à 70V sur 90 min mais les hauts poids moléculaires n'ont pas bien transféré (il restait un peu d'échelle dans mon gel). Quelqu'un a une idée des meilleurs conditions de tranfert pour ce type de protéines J'ai entendu parler de transfert overnight à 4°C 12V.  [...] Pour le transfert de ta protéine, fait le 2H à 100 V (en utilisant un bain de glace bien sûr). Sinon garde le même voltage mais laisse plus longtemps. Je n'utilise pas le PVFD alors moi je transfert avec de l'éthanol qui me donne de meilleurs résultats mais toi tu es obligée de prendre le méthanol.  [...]

[Biochimie] Idée de plan : Chloroplaste, relation structure-fonction ?

Ce qui va plus compter, c'est la précision des explications que tu fourniras, si tu as vraiment réussi à faire un lien entre structure et fonction. rôle des membranes, des microenvironements, structure des photosystèmes et transfert d'énergie par résonance, génome chloroplastique et RuBisCO, stockage des produits et apports en réactifs de la photosynthèse.  [...] Bien que ce ne soit pas le top car la double membrane du chloroplaste garde un grand intérêt dans le transfert de protéines et de bien d'autres molécules (penser au cycle de Hatch et Slack pour les photosynthèses en C4.).  [...]