• Forum - Températures, Hybridation, Sens

[Biologie Moléculaire] Température d'hybridation et MacVector

J'ai désigné deux amorces avec le logiciel MacVector pour faire une réaction PCR. La première amorce sens est de 27 bases et la deuxième antisens est de 21 bases. Lorsque j'ai fait le test des amorces par MacVector, il m'a dit que c'est bon pour les deux amorces et que la température de fusion Tm est de 62,1 pour les deux, et donc je peux conclure que la bonne température d'hybridation est 57,1.  [...] Mais, lorsque j'ai essayé de calculer la température d'hybridation par la fameuse formule 4(G+C) + 2(A+T) j'ai trouvé des températures d'hybridation de 69 pour l'amorce sens et de 61 pour l'amorce antisens. Je demande qui est le plus crédible. MacVector ou la formule classique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Etapes de mise au point qPCR - gène peu exprimé

Vous pouvez sinon tester d'autres conditions, en jouant sur la température, concentration d'amorces et [MgCl2]. Ca peut jouer mais un peu, je serais très surpris que vous gagniez 10 ou 15 Ct comme cela (vos Housekeeping sortent vers combien au juste pour parfaitement ).  [...] J'utilise oligo 4 (sur Mac) pour les dimères et les hairpins, et le logiciel de Perkin elmer fourni avec l'appareil pour les températures d'hybridation.  [...]

[Biologie Moléculaire] signal southern blot

J'ai essayé plusieurs chose, changer les kits de marquages ( digoxygenine ), resynthétiser une sonde, changer de fournisseur, refaire tout les tampons, changer les températures d'hybridation... rien de mieu.  [...] Il y a quelques semaines j'ai coupé ma membrane en deux, j'ai hybridé la premiere partie avec un ancien tampon+sonde avec lequel j'avais obtenu de bon résultat.. et la deuxieme moitié avec le tampon et les sondes que j'utilise ces derniers moi.   [...]

Probléme d'amplification par PCR

J'ai récemment conçu des amorces pour amplifier des gènes dont j'ai envie d'étudier le polymorphisme. Seulement depuis une semaine j'y parvient pas, j'ai joué sur les températures d'hybridation en faisant une PCR gradient mais rien à faire. Avez vous des suggestions à me faire parvenir.  [...] 4. vérifier les séquences (il m'est aussi arrivé de recevoir un oligo mal conçu, qui ne fonctionnait évidemment pas. Il m'est également arrivé de découvrir une faute dans la séquence des bases de données. en fait, il m'est à peu près tout arrivé ).   [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse par PCR : Tm des oligos

Nous devons mettre en relation les températures choisis avec le Tm des oligos mais je ne comprend pas pourquoi nous avons régler l'hybridation sur 55°C alors que les oligos ont un Tm de 79°C... Est ce que quelqu'un pourrait m'aider.  [...] Je crois que j'ai compris. on diminue la température d'hybridation car la séquence de l'oligo n'est pas 100% appariée et donc si on veut qu'elle s'apparie il faut lui laisser du temps.  [...]

optimisation pcr quantitative temps réel

je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.   [...] Tu peux travailler sur tes conditions de cycle. température d'hybridation plus haute, montée progressive de la température pour arriver à 72 °C, voire même travailler avec des amorces plus longues avec des Tm de 60-62°C et travailler en cycle avec 2 températures.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Le problème est qu'après PCR j'obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d'hybridation, différentes TAQ… j'ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j'ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers.  [...] alors ce ne sont pas des problèmes de migration ou d'agarose j'ai vérifié... J'ai pensé à la complémentarité mais quand je séquence le plasmide de départ avec les primers utilisés pour ma PCR je retrouve la séquence attendue, ce qui veut dire qu'ils s'hybrident au bon endroit.   [...]

PCR : Amorces

il existe des programmes pour ca dans la vie courante, mais si tu dois le faire sans programme, tu dois prendre un morceau de la sequence qui t'es donnée (par exemple celle que tu as) compter le pourcentage de CG dedans (rien de bien compliqué, un simple calcul de pourcentage), pour le calcul de la Tm je pense que tu peux utiliser le calcul simplifié c'est a dire (A*2)+(T*2)+(G*4)+(C*4), si la temperature est trop basse tu rajoute quelque nucléotides,  [...] la phusion sont rapides et meme pour de plus grands fragments, de petits temps suffisent, pour les autres temps (autre que le temps d'elongation qui est le troisieme parmi les trois temperatures que tu repetes sur plusieurs cycles) ce sont des temperatures qui servent a séparer le double brin et la temperature d'hybridation de tes amorces, donc ca du moment que la température est la bonne, le temps que tu laisse n'a pas trop possibilité de varier, par exemple si tu a un GC% tres grand, ca va etre plus dur a séparer mais laisser plus longtemps ne joueras pas trop, en tout cas pas autant que d'augmenter la température, donc non ces temps la tu suis ce que dit le fournisseur et c'est bon.  [...]

aide pour réaliser les PCR

La température d'hybridation des amorces se situe généralement 8 à 10°C en-desous de la Tm calculée. Mais il n'y a pas de règle d'or -. faire plusieurs essais à différentes températures (Tm-6,8,10°C par exemple) si obtention de bandes aspécifiques par exemple.  [...] Donc, pour calculer la température d'hybridation (celle que je mettrai sur le thermocycleur (Tm -5°C)), je ne calcule le Tm que sur la base des nucléotides qui s'hybrideront.  [...]

[Biochimie] Correspondance entre 37°C et 4°C

Heu oui et non. La plupart des laboratoires ou entreprises qui développent un réactif font des stabilité à 37°C voir plus. Si il n'y a aucun sens pourquoi faire des stabilité avec de tels températures sachant très bien que en conditions normales elles ne seront jamais atteinte.  [...] En effet, certaines enzymes nécessitent une température de fonctionnement tres tres spécifique, et si tu te mets artificiellement a cette température, je ne pense pas que tu puisses alors comparer deux températures.  [...]