• Forum - Témoin, Colonies, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Ligation

Donc pour moi T1 est un témoin pour montrer le nombre de colonies ayant intégré un plasmide.. Témoin de transformation c'est ça.  [...] Du coup...T2 contenant de la ligase, serait le témoin de ligation oui... Mais je ne vois pas en quoi il montre l'efficacité de la ligation, vu qu'avec ou sans ligase des colonies poussent. Tant que le plasmide est dans la bactérie en gros.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Si oui, les ligations étant effective, on sait qu'un sert peut intégrer plus de 1plasmide à la fois. Comment selectionner par après, les clones n'ayant intégré qu'un seul insert Doit on faire une PCR de colonies de tout les clones obtenus jusqu'à ce qu'on ait le bon clone.  [...] Alors jusqu'à présent j'ai tellement peu de colonie que je les ai toutes testées et effectivement a chaque fois le plasmide ne contient pas l'insert. Pour répondre à ta question c'est un clonage a bout cohésif. Je vais essayé la méthode que tu m'as suggéré.  [...]

plasmide pcDNA3 et mock??

Le plasmide pcDNA3 est ce qu'on appelle un plasmide vide, c'est à dire qu'il contient tout les éléments d'un plasmide classique (promoteurs, gène de résistance, origine de réplication...) mais pas de gène d'intérêt. Il est utilisé comme témoin négatif lors de transfections (transfection de matériel génétique mais pas d'expression de gène) ou comme témoin positif lors de transformations bactériennes (formation de colonies grâce au gène de résistance).  [...] Pour ce qui est du mock, je pense que vous faites erreur, ce n'est pas un plasmide mais cela correspond à un témoin négatif, c'est à dire qu'on ne tranfecte/transforme rien, le plasmide est remplacé par de l'eau dans le milieu de transfection/transformation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Ensuite, as-tu fait des contrôles J'entends par là. as-tu électroporé ton plasmide tout seul que tu étales ensuite C'est un témoin indispensable Puis, as-tu pensé à étaler tes ligations sur des boîtes sans antibio Qui sait, peut-être qu'il y a un problème d'expression de la résistance et tu te retrouves avec des sensibles donc aucune colonie.  [...] Si tu n'as pas de colonies sur un milieu avec ampicilline, c'est que tes bactéries n'ont pas intégré de plasmide. As-tu fait des tranformations avec ces mêmes ligations mais avec d'autres bactéries hier Et ce que tu peux faire, c'est essayer de transformer d'autres cellules avec tes ligations.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] Si vous avez 10 000 colonies sur la boite expérimentales et 10 colonies sur la boite contrôle c'est bon. Vous piquez quelques colonies et vous savez que la majorité de vos clones contiendront l'insert. Si vous avec 10 000 et 8 000, vous savez que vos restrictions de plasmides ne sont pas efficaces et qu'il va vous falloir screener pas mal de colonies pour trouver vos petits. Prévoir un colony lift dans ces cas là.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Ton raisonnement paraît bon. Il manque cependant une petite chose. lorsque tu vas insérer ton vecteur dans tes bactéries pour le produire, il te faut un moyen de déterminer quelles sont les colonies qui expriment ta construction afin de les sélectionner. Tu vois de quoi je parle.  [...] Le rapport nombre de colonies dans la boite témoin/nb de colonies sur la boite insert_vecteur donne une bonne indication de la réussite de la ligation et de l'incorporation de ta construction dans le vecteur. Il y a en général quand même des colonies dans la boite controle, prinicpalement parce que il subsiste quelques exemplaires circulaires de ton vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse (ADN sur Agarose) et Bromure d'éthidium - Page 2

Il y a une différence entre témoin de coupure et estimation de la taille Le plasmide natif est un témoin négatif. il me montre ce que je dois voir sur mon gel si mon enzyme n'a pas coupé. Mais Yoyo parlait de la taille ici. Pour ça, tu as le ladder.  [...] je me demande combien de BET je dois mettre dans le tampon de charge pour bien visualiser mes bandes.   [...]

[Biologie Moléculaire] E.coli DH5a résistante à la paromomycine?!

J'utilise de la paromomycine comme agent de sélection et surprise. j'ai des colonies sur mon témoin négatif qui poussent en présence de l'antibiotique après 48h.  [...] Alors je sais pas, peut-être que quelqu'un à déjà eu ce genre de problème (avec la kana ou la néo sinon, c'est très proche de la paromo) et peu m'aider, parce que si je doit considérer ça comme un bruit de fond de ma souche, ça va pas être terrible.   [...]

Problème de digestion enzymatique

j'ai voulu digérer quelques plasmides afin de confirmer s'ils sont recombinants ou non, 6 plasmides parmi 7 ont été digéré sauf un.  [...] 7- j'allais oublier la dernière possibilité. Votre plasmide n'est effectivement pas recombinant, essayez de recommencer votre insertion. Si vous le pouvez faites une infusion, ça marche plutôt bien quand on sait s'y prendre.  [...]

[Génétique] Experience temoin gene delete

Pour me constituer un temoin, mon tuteur de stage m'a demande d'apporter via un plasmide le gene de la proteine etudiee dans la souche deletee (et donc normalement retablir le phenotype sauvage. Et ainsi s'assurer que la difference observee entre ces deux souches est bien due a la deletion de la proteine et non pas a un effet que pourrait avoir le fait d'enlever simplement le gene (pour exemple deregler un autre gene).  [...] Et c'est ce point qui me pause probleme, pouvez vous me donner un exemple Je ne sais pas si je suis assez claire Grosso modo est ce vraiment un temoin valable Que pourrait il se passer si le fait de rapporter le gene via un plasmide ne redonne pas le phenotype sauvage.  [...]