• Forum - Tampon, Transfert, Protéine, Membrane, Western

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

En fait quand on fait un western, on part du principe que pour des proteines de taille standard, si elle ne sont plus dans le gel apres transfert et coloration au bleu de coomassie, alors elles sont sur la membrane. Ceci est vrai si la polarité a été respectée durant le transfert, sinon les protéines sont dans le tampon et pas sur la membrane (mais dans ce cas, ce sont toutes les protéines).  [...] La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...] Pour répondre au dernier message, pour ma part lors des transferts de ma protéine de 26kDa que je faisais sur membrane PVDF avec le même tampon ou très très proche. Je ne dépassais pas les 25 V mais pendant 50 minute-1h. Maintenant, je t'avoue je n'ai jamais essayé autant de volt et temps pour un transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont coulantes comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire.  [...]

[Biochimie] Electrophorèse : volts, ampères ou watts?

Concrètement qu'en est-il Pour une électrophorèse que dois-je regarder comme valeur Car d'un tampon de migration à l'autre, la conductivité change et un même nombre de volt donnera un nombre d'ampère fort différent.  [...] Il s'agissait d'un transfer gel SDSpage sur membrane pour un Western Blot. J'ai été obligé de modifier le tampon de base et rajouter plus de glycine. Donc la conductivité a pas mal augmenté.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot

Je voudrais savoir ce qu'il arriverait si on interverti le tampon de migration avec le tampon de transfert Donc ma question est. les tampons jouent-ils un role primordial dans le Western.  [...] NB. j'ecris avec un clavier qwerty aussi veuillez m'excuser pour l'absence d' accent.   [...]

[Biologie Moléculaire] Western sur protéine membranaire

Je cherche a effectuer un western sur un extrait de protéine de levure (donc difficile a casser). cette protéine a la particularité d'etre accrochée et retenue a la membrane vacuolaire (ainsi qu'au RE).  [...] Je fais tous mes western sur une protéine membranaire (mais de cellules humaines et pas de levure) en Laemli (je n'ai jamais su l'écrire) ou d'autres tampons style Guanidium, urée, RIPA,... Ca ne marche pas le Laemli chez la levure Est ce que tu as essayé de casser au dounce.  [...]

[Biochimie] Extraction protéique au laemmli ?

J'ai une petite question sur une manip que je fais en ce moment. J'étudie une protéine sur laquelle j'ai fait quelques délétions pour caractériser un peu mieux ces fonctions. J'ai transfecté les plasmides dans des HeLa, extraction des protéines au RIPA, migration et WB.  [...] Afin de voir si elle était exprimé, j'ai regardé en immunofluorescence, et j'ai un signal pour cette protéine. Donc elle est bien exprimé dans mes cellules. Par contre, la localisation de la protéine change et se retrouve dans des structures nucléaires (genre aggrégats).  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Je cherche le moyen d'optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire. Je travaille sur FAS (274kDa) et je n'arrive pas à la transférer.  [...] Il n'y a pas de tampon de transfert étant donné que c'est un transfert à sec. Une fois que ton gel a migré, tu utilises un appareil spécial pour cela et en quelques minutes, c'est transféré. Ca revient un peu plus cher que la méthode classique (7 à 8 euros par transfert de mémoire) mais pour les grosses protéines ça marche largement mieux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot brûlé

J'expose mon problème.. Dans le cadre d'un TP j'ai dû effectuer un Western Blot. Au moment où j'ai voulu récupérer ma membrane de nitrocellulose après transfert, il s'est avéré que tout à cramer./ La seule erreur de faite est que j'ai inversé l'anode et la cathode au niveau du générateur.  [...] Après avoir chercher sur internet je n'ai pas trouvé de réponse expliquant ce problème et ma prof n'avait jamais vu ca avant./.   [...]