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[Biologie Moléculaire] enzyme de restriction

J'ai un problème avec une digestion d'ADN amplifiés par PCR par l'enzyme de restriction Mnl1, une bande supplémentaire que je n'attendais pas apparaît, alors que ma PCR est spécifique et n'est pas contaminée. Mes réactifs de digestion non plus ne sont pas contaminés, j'ai vérifié avec le blanc de PCR.  [...] Cet effet Star n'est pas connu pour l'enzyme Mnl1, mais j'ai constaté que le fournisseur avait récemment changé de tampon de réaction pour cette enzyme, et moi j'ai utilisé l'ancien, ça a peut-être un lien...en tout cas, merci de vos réponses.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Alors, pour synthétiser le brin complémentaire pendant la PCR, il faut des bases azotées (dNTP, les mono-nucléotides), des amorces pour ne répliquer qu'une partie de l'ADN (qui doit correspondre à la partie que tu veux explorer), et un milieu favorable pour que les enzymes de réplication fonctionnent bien (c'est le buffer, qui contient souvent du MgCL2).  [...] L'enzyme va copier l'ADN entre ces deux amorces. Elle a besoin de bases/nucléotides. dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Elle ajoute donc bout à bout chaque base depuis l'amorce de départ jusqu'à l'amorce de fin. D'où l'utilisation de la Taq polymérase, des amorces et des dNTP.  [...]

[Biochimie] PCR: a quoi servent les differents elements

*Le tampon, c'est pour le bon fonctionnement de l'enzyme. il lui faut un pH particulier qui ne doit pas évoluer au court de la réaction. Or, les dNTP et l'ADN n'ont certainement pas les mêmes propriétés acidobasiques. d'où l'utilisation du tampon.  [...] Le gel de migration est pour le même principe de spécificité. On peut simplement mesurer la fluorescence, mais comment être sur que tous les acides nucléiques qui réagissent sont spécifiques de notre réaction On les fait migrer et on regarde leur taille.  [...]

[Biochimie] Localisation de la B-galactosidase

Je voudrais savoir où se situe PRECISEMENT la B-galactosidase dans le corps humain. Peut-elle fonctionner à un pH de 4.2 (j'ai vu sur wikipédia pH optimum entre 6 et 8 mais existe-t-il d'autres formes de cette enzyme Car j'ai également vu sur un site anglais qu'elle pouvait fonctionner comme un lysozyme à pH = 4.5).  [...] Bsr, à partir de mes restreintes informations sur cet enzyme, je peux vous dire ( je crois ) que le B-galactosidase est l'enzyme qui fait catalyser l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose, donc elle appartient à des enzymes de digestion, donc dans le système digestif, et pour l'acidité, on a manipulé cette réaction in vitro avec un tampon pH 7. je ne sais plus de ça dsl ^^.  [...]

[Biologie Cellulaire] PCR et électrophorèse

Je réalise pour la première fois une PCR et une électrophorèse qui va avec et on me demande pourquoi le tampon de la Taq est-il coloré en vert et quel est l'avantage J'ai bien compris que le tampon était indispensable au bon fonctionnement de l'enzyme, mais je ne comprend pas bien l'histoire de la couleur Pour permettre une fluorescence et donc une révélation à l'électrophorèse.  [...] Vous mélangez deux choses. il faut traditionnellement un tampon de réaction, qui permet le fonctionnement de l'enzyme, et un tampon de dépôt, qui permet de stabiliser l'ADN et de déposer l'échantillon dans le puits.  [...]

[Biochimie] Volume réactionnel pris en compte dans une réaction enzymatique.

Mieux vaut-il prendre un volume réactionnel avant ajout d'une solution d'arrêt de réaction, ou un volume comprenant également le volume de solution d'arrêt.  [...] Par exemple, j'effectue une réaction avec 0,5 mL de substrat, 0,5 mL d'enzyme et 2 mL de tampon (volume total de 3 mL à cette étape), que j'arrête avec 1 mL de solution d'arrêt (volume passant de 3 à 4 mL). Les absorbances des différentes solutions sont ensuite mesurées.  [...]

calcul???

j'ai une manip estimation de l'activité enzymatique. j'ai vu sur un article qu'il faut broyer 1g de feuille avec 5ml du tampon phosphate 50mM (pH7). après une fois qu'on aura preparé l'extrait enzy, l'estimation de l'enzyme SOD se fait selon la reaction suivante.  [...] - comment avoir les volumes à utiliser pour chaq sub pour la réaction est ce que je devrais préparer des solutions mère avec des concentrations que je définie et après je calcul le Volume de prise de cette solution pour avoir la concentration demandé dans le volume de 3ml de reaction.  [...]

[Biochimie] Utilisation du bain marie dans le dosage des enzymes

Est-ce que je dois placer juste le tampon au bain mari ou je dois placer la dedans aussi la substance que j'ai préparé et qui doit réagire avec l'enzyme.  [...] De plus, votre réaction enzymatique va durer plusieurs minutes alors que les échanges thermiques se feront beaucoup plus vite dans ces conditions et seront terminés au moment où vous ferez vos observations sur l'activité de l'enzyme (le calcul de la vitesse de réaction ne se fait pas au tout début de la réaction).  [...]

[enzymologie] Activité enzymatique et flux

Tu peux essayer de réaliser une colonne enzymatique en incluant ton enzyme dans un résine et tester différents tampons, et entre chaque tampon il va falloir que tu laves avec un tampon de référence pour mesurer une activité de référence car certains tampons testés pourraient dénaturer ton enzyme.  [...] Pour cela on va chauffer l'enzyme en la mélangeant à une résine qui se liquéfie à une température de 40-42°, on applique le mélange dans une burette chaude et on fait goutter la burette dans le tampon initial de l'enzyme (Tris par exemple) à tempréature ambiante ou même plus froid.  [...]

[Biochimie] Sollution tampon votre avis

Est-ce que les composantes de ce tampon ne risque pas de réagir avec celle du tampon que je vais utiliser pour le dosage de l'enzyme (le tampon que dicte le protocole du dosage de l'acétylcholéstérase, destiné à offrir un pH idéal pour la réaction). Ne risque t'il pas de réagir aussi avec la acétylcholine que je vais préparer et le DTNB (l'enzyme doit dégrader l'acétylcholine pour donne du thiocholine qui va ce lier au DTNB et le spectrophotometre va mesurer l'absorpition du produit thicholine-DTNB).  [...] Ensuite concernant ta seconde question. Difficile a répondre sans connaitre ton protocole expérimental (composition tampon, volume tp vs volume extrait enzymatique,...). Peux tu me donner quelques élements de réponses si ce n'ai pas trop confidentiel Mais sache qu'il existe des méthodes pour changer de tampon après ton extraction pour conditionner ta protéine dans un autre tampon... (Dialyse, unité de concentration,...).  [...]