• Forum - Tampon, Extraction, Protéine

[Biochimie] Sollution tampon votre avis

Le tanpon que tu souhaites utiliser est un tampon d'extraction donc pour moi le plus important c'est qu'il te permettes d'extraite ta protéine avec un rendement maximal et tout en gardant l'activité de ta protréine. La composition que tu as donné me parait classique.  [...] Ensuite concernant ta seconde question. Difficile a répondre sans connaitre ton protocole expérimental (composition tampon, volume tp vs volume extrait enzymatique,...). Peux tu me donner quelques élements de réponses si ce n'ai pas trop confidentiel Mais sache qu'il existe des méthodes pour changer de tampon après ton extraction pour conditionner ta protéine dans un autre tampon... (Dialyse, unité de concentration,...).  [...]

[Biochimie] SDS page

aprés extraction des protéines. je n'arrive ppas à obtenir des bandes sur mon gel polyacrilamides. même si je précipite mes protéines avec l'acétone. il faut noter qu'il y à smire (trajectoir) sur mon gel. est ce que quelqu'un peut m'aider.  [...] le tampon phosphate permet l'extraction des protéine totales d'une poudre vegetale, au moin tu sera sure de l'existance de votres protéines, en plus c'est un protocol trés simple.  [...]

Purification protéine taggée avec HIS6

Je prevois de tenter la purification d'une protéine taggée en His6 a partir d'un extrait de levure sur une colone de nickel.  [...] Je dirai que le problème majeur est bien avant la purif et se trouve dans la production et la solubilité de ta protéine dans ton tampon d'extraction. Es-tu contraints de faire ca dans la levure Quel niveau de pureté dois-tu obtenir.  [...]

additifs pour la cristallisation des proteines membranaires

Cependant il n'y a pas un coktail d'additif et de détergents précis. Il y en a beaucoup, et tu n'es pas sans savoir que cristalliser une protéine membranaire c'est la croix et la bannière (y a qu' a voir la PDB) donc en général on fait les tampon de cristallisation à taton (maintenant ce sont même des labos ultra équipé avec de la robotique qui s'amusent à faire des centaines de cribles pour trouver le bon tampon qui va bien).  [...] Oui effectivement, la GlpG est une proteine membranaire, son extraction de la membrane necessite un détergent, et dans l'article on parle de la solution tampon Hepes, NaCl, Glycerol,... je pense que c'est le detergent en question si on se réfère à http.//biochimiedesproteines.espacew...oke.ca/5d.html.  [...]

[Biologie Moléculaire] kinase

Un test que tu peux tenter juste pour savoir si ta proteine est phosphorylee et dans le cas ou tu peux immunoprecipiter ta proteine est de faire une immunoprecipitation dans differente condition de stringence et incuber ton immunoprecipitation dans un tampon de reaction adequate pour les kinases avec de l'ATP32.  [...] D'une maniere generale, lorsque tu cherches a montrer une phosphorylation, tu utilises des anti-phosphatases dans ton tampon d'extraction de la proteine ou de lyse des cellules. Rien ne t'empeche de l'utiliser dans ton lysat de reticulocyte. Celui utilise est souvent l'orthovanadate de sodium, tres efficace et spectre tres large.  [...]

[Biologie Moléculaire] Impossible de récuperer ma protéine GST-X

je produit en Bl21 des protéines GST-X, la production a été mise au point et la protéine est bien exprimée. Lorsque je veux récuperer cette protéine, j'utilise un tampon de lyse contenant du lysosyme, Dnases ( avec MgSo4 et CaCl2) à de très forte concentration, il y a du triton, du chaps et une forte concentration en sels à 1M, tris-Hcl à pH8 mais je n'arrive en aucun cas à sortir ma protéine.  [...] Lorsque je mets mon tampon de lyse, j'incube toute la nuit à 4°C j'obtiens un leger changement de turbidité puis je sonique pour bien casser tout l'ADN qui pourrait gener mon extraction puis je centrifuge 40 min a 13000 mais lorsque je verifie au bleu de coomassie en passant par gel SDS-page ma protéine reste dans le culot.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pull down GST

j'essaye de produire une protéine en fusion avec la GST afin de faire des tests d'interaction pull-down avec des extraits cellulaires.  [...] Si ta production n'est pas très grande, attention toutefois à la quantité de billes nécessaire, car plus il y a de billes, plus tu augmentes la possibilité d'intéractions aspécifiques avec les billes. Ta protéine est elle soluble Car il se peut aussi qu'elle soit produite en grande quantité, mais non solubilisée dans le tampon d'extraction.  [...]

[Biochimie] Extraction enzymes

Pour réaliser l'extraction des enzymes de l'orge, j'ai procédé à un broyage de grains d'orge avec de l'eau distillée puis à une filtration et enfin une centrifugation pour récuperer les enzymes.  [...] Un tampon est généralement mieux car il permet de limiter les variations de pH qui pourraient dénaturer l'enzyme au cours de l'extraction. D'autre part, il peut y avoir dans les tampons des inhibiteurs de protéases ou autres agents assurant la stabilité de l'enzyme car une extraction met la protéine recherchée en présence de composés nocifs pour la protéine.  [...]

Précipitation protéines au sulfate d'ammonium

Je me dis qu'il faut certainement le préparer dans l'eau mais du coup, je fais diluer le tampon d'extraction de ma protéine. Dans la publication, les auteurs ne spécifient rien. Pourriez vous m'éclairer svp.  [...] Effectivement, à ta place, je diluerai les solutions stocks dans de l'eau. Il suffit juste que tu adaptes leur concentration pour qu'in fine tu obtiens la bonne concentration finale dans ton tampon d'extraction.  [...]

[Biologie Cellulaire] etude du niveau de phosphorylation d'une protéine en WB

Pour l'extraction, si tu veux conserver les phosphorylations de ta protéine, il faut de l'orthovanadate de sodium (inhibiteur de phosphatase) dans le tampon et éventuellement d'autres inhibiteurs. Mais surtout garder les échantillons dans la glace le plus possible une fois l'extraction faite, cela limite d'autant plus les déphosphorylations.  [...] je vais essayer une technique d'extraction avec des inhibiteurs, j'ai trouvé un protocole qui me semble adapté, et j'effectuerai un dosage avant de déposer.  [...]