• Forum - Tag, Site, Restriction

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée qui ne fonctionne pas

Voilà, j'ai un plasmide de 10Kb dans lequel je souhaite insérer 3 nucléotides à un endroit bien particulier pour créer un site de restriction. Une fois ce site de restriction présent j'insèrerai mon tag Flag. L'un des points limitant c'est que je souhaite insérer flag dans une boucle extracellulaire courte de ma protéine finale.  [...] 2) Si, soyons fou, je décide d'insérer Flag flanqué de mon site de restriction (le but est de pouvoir ensuite changé le tag comme bon me semble..quand on est fou on est fou.) tout entier à la place des 3 nucléotides et donc d'avoir dans mes primers centraux une extrémité libre strictement non complémentaire (pas d'hairpin et tout le bazar non plus).  [...]

[Biochimie] Tag His en N Ter???

J'utilisais jusque là le vecteur pET-21a et me suis rendue compte que le tag se trouvait en C ter. Malheureusement, la structure 3D de ma protéine fait qu'il se retrouve ensuite à l'intérieur et n'est donc pas accessible pour la purification sur colonne de nickel.  [...] Tu veux dire que lors de la PCR au cours de laquelle j'introduis mes sites de restriction spécifiques, je design les amorces de telle sorte qu'elle contienne à la fois le tag his et le site de restriction d'un côté et de l'autre le site de restriction suivi du codon stop.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique GST-Pull Down

c'est ça. Le truc c'est qu'il n'existe pas toujours d'anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt ou d'anticorps bien spécifiques alors que ceux qui reconnaissent la GST le sont. Il existe aussi des techniques pour récupérer la protéine sans le tag à la fin, par exemple en clonant un site de restriction SapI entre le cDNA de la prot et celui de la GST.  [...] L'enzyme de restriction SapI coupe la séquence d'ADN SapI et une protéase (dont j'ai oublié le nom) coupe cette même séquence une fois traduite.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On utilise des enzymes de restrictions pour isoler le gène d'intérêt, son promoteur, etc... et en parallèle on a recours à d'autres enzymes de restriction pour couper le vecteur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

[Biologie Moléculaire] insertion d'un tag HA au milieu d'une sequence.

D'autres equipes ont deja tague ce recepteur et je veux donc inserer mon HA au meme endroit de la sequence que ces equipes pour ne pas alterer la fonction de mon recepteur. Bien evidemment je ne peux pas cloner ce tag car il n'ya pas de site unique de restriction a cet endroit. Comment pourrais-je donc faire.  [...] Si vous voulez reproduire exactement la construction qu'ils ont réalisé, le mieux est de leur demander carrément qu'ils vous en envoient un échantillon. Cela évite de refaire des manips inutilement et de leur côté, ça leur assure de figurer dans les remerciements de la publication que vous ferez avec leur construction.   [...]

[Biologie Moléculaire] the Genome walking method

3) Ligature en condition dilluée à 4°C pour favoriser l'auto-circularisation des fragment d'ADN (même site de restriction ).  [...] La première étapes consiste a construire une banque de fragment tagé (restriction et ligation du tag). Et après y a une PCR et une nested a faire, avec une amorce spécifique de ta séquence connu et une amorce spécifique du tag.  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

C'est pas détaillé mais il manque encore des infos. nature/taille de l'insert y a-t-il des sites de restriction pour le sortir de l'ancien vecteur faut-il cloner en phase avec quelque chose (Tag, protéine de fusion).  [...] 2 de nucléotides (acides aminés = protéine...), autour de 20, plus la partie qui contient le site de restriction, plus quelques uns pour permettre la bonne digestion par l'enzyme. une trentaine en tout.  [...]

[Biologie Moléculaire] problemes de digestion de plasmides

j'utilise un plasmide pET 28a pour faire un clonage chez coli mais les différente digestion de ce ce plasmide par EcoR1 Hind3 Xba1 Kpn1 incuber plus ou moins longtemps ne me permette pas d obtenir une digestion correcte. quelqu un a déjà eu ce genre de résultats comment y palier comment l'interpréter.   [...] ou un autre plasmide possédant des site nde1 xho1 avec un tag his et utilisable chez bl21de3.  [...]

[Biochimie] Comment synthetiser une peptide recombinant ?

Merci pour ces renseignements. Mon peptide ne nécessite aucune modification post-traductionnelle. Par contre, une bonne pureté sera nécessaire. En outre, j'aurais besoin d'une relativement grande quantité de ces peptides. La méthode chimique apparait donc comme la meilleure dans mon cas.  [...] Merci beaucoup pour ces remarques. Mais a propos du tag, ne serait-il pas envisageable de l'utiliser pour la purification, et, ayant aussi inséré un site de clivage, d'utiliser une protéase en vue de retirer le tag Par exemple un tag GST.  [...]

[Biologie Moléculaire] purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

la carte de mon plasmide est comme suit. une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor. cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.  [...] Désolé mais je n'ai jamais utilisé le facteur X. J'ai le site de clivage de la protéase du TEV sur toutes les protéines que j'utilise. Je sais juste qu'il faut faire plus attention avec le facteur X car, contrairement à la protéase du TEV, il a tendance à digérer également ta protéine.  [...]