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RT PCR et après ....

Le second probleme evetuel est la quantite de ton amteriel de depart. Si tu es parti d'ARN totaux, je te conseillerais de faire d'abord une purification des ARN polyA, ca enrichira la quantite de ton ARNm dans la popluation d'ARN.   [...] J'oubliais de dire, qu'une autre facon de tester l'expression de ton gene, est de verifier la presence de la proteine par western blot. en comparant cela avec les proteine d'une cellule non transfectee. Cela necessite, cependant, d'avoir des anticorps contre ta proteine, ou d'avoir ajouter un tag a ta proteine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Lyse cellulaire

Je voudrais savoir s'il est possible de lyser des cellules pour récupérer par co-IP une protéine liée à un lipide. Parce que forcément la lyse cellulaire va entraîner une rupture des interaction lipides-protéines et donc du complexe que je cherche à récupérer.  [...] Je confirme. pas évident en fait. Un crossllinker = un TAG qui viendrait se fixer sur la protéine Comment le faire entrer dans la cellule.  [...]

Immunoprécipitation de la chromatine

Je crois avoir mal prise mes notes de cours sur cette méthode car je ne comprends pas le lien entre le protocole et l'objectif de cette méthode... J'ai recherché sur internet haha mais pour le coup c'était au dela de mon niveau de compréhensions.   [...] La ChIP permet d'identifier le site de fixation d'une protéine sur l'ADN. Il faut posséder l'anticorps spécifique de la protéine qui t'intéresse (ou alors exprimer une protéine taggée dans ta cellule et avoir un anticorps anti-tag). Donc tu extrais les complexes ADN/protéines des cellules, tu les découpes en courts fragments (qq centaines de paires de bases par exemple pour commencer) tu incubes avec ton anticorps.  [...]

[Biochimie] Les Tag en biologie moléculaire

L'idée c'est d'accrocher à ta protéine recombinante quelques chose d'utile. ça peut être une séquence qui va coder pour de la fluorescence (détection de ta protéine recombinante dans la cellule par ex), pour un affinity tag (qui va te permettre par exemple d'isoler ta protéine recombinante par une chromato d'affinité), une séquence en Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, qui permettra l'utilisation de FLAsH ou REAsH, un tag qui va modifier la solubilité de ta protéine, un His tag (tag constitué de plusieurs histidines),  [...] Le tag histidine qui est enfaite un tag polyhistidine (6 his consécutifs) interagit fortement avec les ions. Dans la chromatographie par affinité des ions sont fixés sur la résine, lorsque la protéine possédant le tag His passera par là elle se fixera aux ions. Cela te permettra d'isoler la protéine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine étiquetée

C'est une protéine où on va lui coller une séquence Tag (exemple, l'histidine) et ça permet de savoir quel dose de protéines exogènes tu utilise dans ta culture cellulaire.  [...] Le tag est une séquence d'acides aminés rajoutés en amont ou en aval de ta protéine et permet de la visualiser (tags fluos) ou de la purifier (his tag, gst tag...).  [...]

Problème de biologie moléculaire

Ensuite, pour prouver que la localisation contribue au phénotype... Je ferai une modif' rapide au gène, j'y ajouterai un TAG de signal d'exportation nucléaire, ensuite je pourrai vérifier à l'aide de a GFP que la protéine ne se trouve plus dans le noyau et grâce à un test d'intégrité de la membrane au Calcium (classique), je pourrai vite voir s'il y a une différence entre la cellule avec le facteur exporté et non exporté du noyau.  [...] .. La traduction s'effectue dans le cytoplasme de la cellule. Si la GFP donne un signal à l'intérieur du noyau, cela veut dire que la protéine a été importée, sinon elle serait bloquée dans le cytoplasme. De ce fait, cela me porte à croire qu'il s'agît bien d'un TF ou quelque chose d'autre qui influe sur une protéine liée à l'intégrité membranaire.  [...]

[Biochimie] Séquence Kozak

Je vais donc en mettre une aussi devant la séquence codant pour le tag.Ma question. est-ce qu'il faut supprimer la séquence Kozak devant l'atg de la protéine pour ne plus avoir que celui en tête du tag ou cela n'a-t-il pas d'importance.  [...] En théorie si on met une séquence avant et une séquence après le tag (avant la protéine) il est possible que l'initiation de la traduction commence avant le tag (s'il a bien un ATG...) et aussi avant la protéine (après le tag).  [...]

ubiquitine et protéasome

Je t explique la manip. Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation.  [...] Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

quelqu'un aurait de l'expérience en IF voici mon problème. j'ai jusqu'à présent travaillé avec des cellules vivantes en fusion GFP. Désormais je dois faire des IF sur cellules fixées. Pas de problèmes pour un marquage de la tubuline (avec des anticorps) ou pour un marquage actine (avec de la phalloidine), mais pas moyen d'avoir un signal avec ma protéine d'intérêt.  [...] fixation à la PFA, je n'utilise pas de méthanol étant donné que ma protéine pourrait avoir un lien avec le cytosquelette et il me semble que la fixation méthanol n'est pas top pour le cytosquelette... j'ai testé avec ou sans permeabilisation avec du triton, blocage lait ou blocage serum ou pas de blocage.  [...]

[Biologie Cellulaire] Manip de co-IP??? what's wrong!!!

En fait, je crois qu'on peut incriminer tout (l'Ac, les billes le tag...), je voudrais juste attirer votre attention à un détail. C'est que j'ai réalisé dernièrement deux manip d'IP anti V5, la première avec la protéine A j'avais un lysat cellulaire totale (non transfecté par V5) et un autre transfecté V5, la deuxième manip d'IP réalisée avec la protéine G, idem.  [...] j'immunoprécipite et là je révèle la topo2 dans tous les culots d'IP même dans les cellules non transfectées V5 (je rappelle que l'Ac immunopricipitant et l'anti V5 qui tague ma protéine d'interêt). je suis resté bouche B, et je suis rentré chez moi pour dormir.  [...]