• Forum - Tag, Cellule, Anticorps

RT PCR et après ....

Un des points critiques quand tu fais un grand nombre de cycle de PCR (35) est de t'assurer de l'absence de contaminants, et surtout que tu n'amplifies pas l'ADN. Pour cela un traitement efficace a la DNAse est absolument indispensable.   [...] J'oubliais de dire, qu'une autre facon de tester l'expression de ton gene, est de verifier la presence de la proteine par western blot. en comparant cela avec les proteine d'une cellule non transfectee. Cela necessite, cependant, d'avoir des anticorps contre ta proteine, ou d'avoir ajouter un tag a ta proteine.  [...]

[Biochimie] Immunoblotting, anticorps

Ma question porte sur les anticorps qu'ils ont utilisés... Au lieu de prendre un anticorps contre tout l'enzyme (anticorps qui existe), ils ont préféré d'abord ajouter - par clonage - une séquence tag et ensuite utiliser un anticorps contre ce tag.  [...] ben oui, l'anticorps spécifique reconnaitrait les deux, alors que l'anti tag ne reconnait que la recombinante. Comme ca tu es sur que ta construction s'exprime, et tu peux en plus purifier ta protéine en utilisant ce tag (d'ailleurs c'est peut être ce qui a été fait non ).  [...]

[Immunologie] comment doser une proteine ?

-marquage par anticorps dirigés contre tes protéines, avec des anticorps contenant une séquence d'affinité ( affinity tag, je sais pas comment le dire en français).  [...] mais ça ne marcherai que si tu as une concentration suffisamment grande à la base, ce qui n'est surement pas le cas avec des virus.   [...]

[Biochimie] Biologie cellulaire proteine

Quel est à votre avis la méthode que l'on doit utiliser pour localiser une proteine dans une cellule Je pensais à l'immunofluorescence.  [...] Immunofluo pour l'histologie, immunogold si on cherche une localisation en microscopie électronique. On peut aussi faire un tag-GFP. Promega a mis au point un autre tag dit HaloTag qui permet de réaliser le couplage avec un fluorochrome tout en gardant la cellule en vie.  [...]

Purification et extraction des protéines....

POur casser tes cellules une sonication sera plus efficace. Ensuite ton gène n'est il pas sous promoteur inductible (par l'IPTG par exemple) car si c'est le cas, il faut une période d'induction avant le cassage.  [...] Le [His]6 tag va vous permettre (1) de purifier et (2) de faire vos WB facilement en utilisant un anticorps dirigé contre lui plutôt que de courir contre un anticorps dirigé contre la protéine.  [...]

[Biochimie] GST pulldown

Mais alors je me permets de te joindre l'image de l'article... Je n'arrive pas à décrypter dans quel sens ils font quoi, qu'est-ce qu'ils ont purifié puis quels sont les anticorps utilisés... Ni pourquoi il y a utilisation de Ponceau.  [...] Les deux méthodes ont leurs avantages et inconvéninents. le tag myc est très petit (environ 1 kDa), par contre son utilisation est couteuse car il doit être reconnu par un anticorps. A l'inverse, le tag GST est une vraie protéine d'environ 26 kDa, dimérique (ça peut avoir des conséquences sur la cible), mais bien plus simple et moins couteuse a utiliser (l'élution se fait par le glutathion).  [...]

Interactions Protéine-Protéine

Chaque protéine a un tag différent. L'interaction est physique si tu obtient un signal en révélant avec un anticorps dirigé contre la protéine 2 alors que tu as fait une immunoprécipitation préalable avec un anticorps dirigé contre la protéine 1.  [...] Malheureusement, par cette méthode si les protéines n'interagissent pas, ca ne voudra pas forcement dire qu'elles n'interagissent pas ensemble dans la cellule et vis vers ca. On peut sinon utiliser la méthode de double hybride mais il peut aussi y avoir des faux positifs avec des partenaires intermédiaires.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Oui nous avons saturé la membrane, mais je pense que le fait d avoir utilisé un anticorps contre le tag et non contre la proteine explique en partie la detection d autres prot.  [...] Sinon, des soucis avec votre anticorps Puisque c'est reproductible Ou vous avez vraiment mal fait la purif', donc du coup il y a autre chose que l'anticorps reconnaît.  [...]

[Biologie Moléculaire] Lyse cellulaire

Je confirme. pas évident en fait. Un crossllinker = un TAG qui viendrait se fixer sur la protéine Comment le faire entrer dans la cellule.  [...] J'ai trouvé une solution en fait. créer un mutant de notre protéine avec uniquement le domaine qui m'intéresse plus quelques acides aminés pour le lier à un anticorps sur une colonne. Reste à faire passer les lipides dans la colonne et récupérer le complexe. Je pense que ça peut le faire.  [...]

Le gel natif

premièrement, j'ai réalisé un SDS-Page puis transfert/révélation par l'anticorps anti-tag pour vérifier la taille du monomère, mais j'ai eu également des bandes qui sont presque au double et le triple de ce poids... donc il s'agit probablement de complexes.  [...] Ce qui me pose problème c'est que pour un gel natif on ne met pas de détergent pour observer les interactions ou la forme de la prot. Après les gels natifs c'est loin pour moi, mais en tous cas je ne pense pas que tu observes des complexes en sds-page. Si tu as vraiment envie de savoir ce que c'est tu px tjr voir en spectro de masse ap excision de la bande d'intérêt de ton gel suivi d'une digestion in gel par de la trypsine. Bon courage.   [...]